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文檔簡介
1、研究背景:
隨著環(huán)境污染加重,人口老齡化加劇,中樞神經系統(tǒng)(Central Nervous System, CNS)疾病發(fā)病率日漸上升,嚴重危害人類健康。這些CNS疾病的臨床治療都面臨一個共同的瓶頸——血腦屏障(Blood-Brain Barrier,BBB)。BBB主要由內皮細胞間緊密連接(Tight Junction, TJ)構成,對循環(huán)血液中的物質具有嚴格選擇透過機制,從而保證 CNS的正常功能。然而 BBB在阻止異物入
2、侵腦組織的同時,也阻止了大部分治療藥物進入腦病變區(qū)域。如何安全有效地開放 BBB,一直是研究者關注的焦點。
本實驗室前期研究發(fā)現,電磁輻射(Electromagnetic Radiation, EMR),尤其是電磁脈沖(Electromagnetic Pulse, EMP),可導致BBB通透性的可逆性增加。但EMP誘導BBB通透性增加的最佳物理參數尚不清楚。此外,其他參數EMR是否也具有該效應?其效應規(guī)律如何?亦不清楚。為解決
3、上述問題,本研究以 SD大鼠為實驗對象,研究了不同參數EMR,如EMP、超寬譜電磁脈沖(Ultra-Wide Band Electromagnetic Pulse, UWB-EMP)和射頻輻射(Radiofrequency Radiation, RFR)對BBB通透性的影響。
研究目的:
探討不同參數EMR(EMP、UWB-EMP、RFR)對BBB通透性的影響,為EMR開放BBB的臨床應用提供初步理論和實驗依據。
4、r> 第一部分 EMP對BBB通透性的影響
材料與方法:
1輻照源:SPG200-EMP輻照源,輻照腔內為均勻的電磁場,場強350kV/m。脈寬可調為50ns或7ns。脈沖次數可設置為0~6000次。重復頻率1Hz。
2動物分組及輻照參數:健康成年雄性SD大鼠108只,隨機分為輻照組(84只)和假輻照組(24只)。輻照參數具體如下:
2.1不同脈沖次數EMP對BBB通透性影響:場強350kV/m
5、、脈寬50ns,脈沖次數分別為100、200、400、800、1600次,于全身輻照后3h取材。
2.2不同脈寬EMP對BBB通透性影響:場強350kV/m、脈沖次數200次,脈寬分別為7、50ns,于全身輻照后3h取材。
3檢測方法:以內源性白蛋白和外源性伊文思藍(Evans Blue, EB)為血管通透性示蹤劑,分別應用免疫組化和EB熒光顯微鏡觀察等方法檢測輻照后BBB通透性。
研究結果:
1
6、、不同脈沖次數EMP對BBB通透性的影響:場強為350kV/m、脈寬為50ns時,經脈沖次數為100、200、400、800、1600次EMP輻照后3h,大鼠腦額葉皮層部分微血管周圍出現不同程度白蛋白免疫陽性產物(P<0.05);其中200次EMP輻照后,周邊出現免疫陽性染色的血管數最多、陽性范圍最大,100和400次輻照組次之,800和1600次EMP輻照組則與假輻照組相比無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。EB熒光結果與白蛋白免疫組化結果
7、基本一致。說明:200次EMP輻照后,BBB通透性增加最明顯;脈沖次數超過400次后,EMP可能未引起明顯的通透性增加。
2、不同脈寬 EMP對BBB通透性的影響:場強為350kV/m,脈沖次數為200次時,經脈寬7ns或50ns的EMP輻照后3h,大鼠腦額葉皮層部分微血管周圍出現白蛋白免疫陽性產物(P<0.05),呈散在分布;脈寬為50ns時,白蛋白免疫陽性范圍更大。說明隨著脈寬的增寬,BBB通透性逐漸增加。EB熒光顯色結果
8、則顯示,在該輻照條件下,僅脈寬為50ns時,BBB通透性顯著增加(P<0.05)。
第二部分 UWB-EMP對BBB通透性的影響
材料與方法:
1、輻照源:UWB-EMP輻照源,由脈沖發(fā)生器和喇叭天線構成。距離喇叭口不同位置處場強不同,據此可選擇輻照場強。脈寬不可調,在1ns之內。脈沖次數可根據實驗需要設置。重復頻率10Hz。
2、動物分組及輻照參數:成年雄性SD大鼠180只,隨機分為輻照組(13
9、2只)、陽性對照組(12只)和假輻照組(36只)。輻照組具體參數如下:
2.1不同場強UWB-EMP對BBB通透性影響:脈沖次數20000次,場強分為50、200、400kV/m,全身輻照后3h取材;
2.2 UWB-EMP對BBB通透性影響的時效規(guī)律:場強400kV/m、脈沖次數20000次,全身輻照,根據輻照后取材時間分為0.5、3、6、24h組。
3、檢測方法:以內源性白蛋白、血清S100β蛋白和外源
10、性EB為血管通透性示蹤劑,分別采用免疫組化、酶聯(lián)免疫吸附測定(Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA)和 EB熒光顯微鏡觀察法檢測輻照后 BBB通透性;采用免疫印跡法(Western Blotting, WB)、免疫熒光染色法分析TJ相關蛋白ZO-1的表達水平和分布。
研究結果:
1、不同場強UWB-EMP對BBB通透性的影響:脈沖次數20000次時,經場強為50、200、4
11、00kV/m的 UWB-EMP輻照后3h,大鼠腦額葉皮層出現散在分布的白蛋白免疫陽性染色;場強為400kV/m時,白蛋白滲出最多(P<0.001),其他組與假輻照組相比無統(tǒng)計學差異。EB熒光結果與白蛋白免疫組化染色結果一致。說明脈沖次數為20000次、場強為400kV/m時,UWB-EMP可顯著增加BBB通透性。
2、UWB-EMP對BBB通透性影響的時效規(guī)律:場強為400kV/m、脈沖次數為20000次時,UWB-EMP輻照
12、后0.5h,大鼠腦額葉皮層白蛋白滲出開始增多;輻照后3h—6h白蛋白滲出最多(P<0.05);輻照后24h組,白蛋白染色結果與假輻照組基本相同(P>0.05)。EB熒光結果與白蛋白免疫組化染色結果一致。血清S100β蛋白 ELISA檢測結果顯示,UWB-EMP輻照后6h血清 S100β含量顯著增多(P<0.05)。以上結果說明:UWB-EMP輻照后0.5h,BBB通透性即開始增加,于輻照后3-6h之間達到最大,輻照后24h基本恢復正常。
13、
3、UWB-EMP輻照后,TJ相關蛋白Zonula Occludens1(ZO-1)檢測結果:400kV/m、20000次UWB-EMP輻照大鼠后,WB法檢測發(fā)現,輻照后3h和6h腦額葉皮層ZO-1蛋白水平明顯降低(P<0.05)。免疫熒光染色結果顯示,輻照后3h,ZO-1免疫熒光強度減弱,而分布方式依然為連續(xù)性分布,各組ZO-1蛋白分布無明顯差異(P>0.05)。以上結果提示UWB-EMP可能通過降低ZO-1的表達暫時、可
14、逆地增加BBB通透性。
第三部分 RFR對BBB通透性的影響
材料與方法:
1、輻照源:RFR輻照源,頻率1840MHz,輸出功率可調,輻照時間可調。
2、動物分組及輻照參數:健康成年雄性SD大鼠36只,隨機分為輻照組(18只)和假輻照組(18只)。輻照參數:頻率1840MHz,比吸收率(Specific Absorption Rate, SAR)2W/kg,每天輻照1h,連續(xù)輻照7d,輻照結束后
15、即刻取材。
3、檢測方法:以內源性白蛋白和外源性硝酸鑭為血管通透性示蹤劑,分別采用免疫組化和透射電鏡法觀察輻照后BBB通透性;采用WB分析TJ相關蛋白ZO-1表達水平。
研究結果:
經1840MHz、2W/kg RFR連續(xù)輻照7d后,大鼠腦額葉皮層白蛋白免疫陽性染色明顯增多。硝酸鑭示蹤法顯示,輻照后大鼠腦皮層部分微血管基底膜處有鑭顆粒沉積,周圍腦實質內有少量鑭顆粒滲入。WB法檢測ZO-1表達水平發(fā)現,RFR
16、輻照后ZO-1表達水平明顯下降(P<0.001),提示TJ損傷可能是RFR輻照后大鼠BBB通透性改變的原因之一。
研究結論:
1、當場強350kV/m、脈寬50ns、脈沖次數200次時,EMP誘導BBB開放的效應最明顯。
2、當場強400kV/m、脈沖次數20000次時,UWB-EMP致BBB開放效應最明顯,且為短暫、可逆的開放;UWB-EMP可能通過降低ZO-1表達,誘導BBB通透性改變。
3、
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