腸道病毒71型感染間充質(zhì)干細(xì)胞后microRNA的表達(dá)變化及其相關(guān)通路.pdf

1、研究背景:
　　手足口病(Hand，footandmouthdisease，HFMD)是一種病毒性疾病，具有傳染性。以發(fā)熱、厭食、口腔黏膜多發(fā)性潰瘍，和主要分布于手足等部位的小皰疹、斑丘疹為特點(diǎn)。病人大多為5歲以下的嬰幼兒。自1997年開(kāi)始，手足口病在亞太區(qū)域的流行日趨嚴(yán)重，2008年在安徽阜陽(yáng)、新加坡，2009年在廣東，手足口病的暴發(fā)和流行造成了成千上萬(wàn)的患兒，甚至導(dǎo)致了數(shù)百兒童的死亡。但遺憾的是手足口病的致病機(jī)制現(xiàn)今仍不明確，

2、也沒(méi)有針對(duì)性的的疫苗和抗病毒藥物。
　　腸道病毒71型(Enterovirus71，EV71)為小RNA病毒科(Picornaradae)、腸道病毒屬(Enterovirus)的成員之一，是已知的手足口病的主要病原體之一，對(duì)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Centralnervoussystem，CNS)有極高的感染性。1969年，EV71第一次從糞便標(biāo)本中分離出來(lái)，在之后的幾十年里該病毒已經(jīng)在全世界許多國(guó)家中導(dǎo)致了多場(chǎng)流行與暴發(fā)，而且其預(yù)后差，

3、病死率高，被視為脊髓灰質(zhì)炎病毒(Poliovirus)被控制后的危害最大的嗜神經(jīng)性腸道病毒。
　　MicroRNA（miRNA）是一種內(nèi)生的、高度保守的非編碼的單鏈RNA，長(zhǎng)約20～24個(gè)堿基。研究證明miRNA不僅在各類原核、真核細(xì)胞中起到重要的轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)節(jié)作用，還參與了EV71與宿主之間復(fù)雜的相互作用。一方面，宿主細(xì)胞利用miRNA影響EV71自我復(fù)制，另一方面，EV71也可以利用miRNA影響細(xì)胞基因表達(dá)進(jìn)而干擾細(xì)胞的

4、正常功能。本研究嘗試以人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(humanumbilicalcordmesenchymalstemcells，huc-MSCs)作為EV71體外感染的細(xì)胞模型，通過(guò)基因芯片和生物信息學(xué)技術(shù)研究miRNA在EV71感染過(guò)程中的改變，并探討其潛在的作用機(jī)制。
　　目的:
　　本課題的目的是探討MSC細(xì)胞對(duì)EV71病毒的易感性及以其作為研究EV71致病機(jī)制的細(xì)胞模型的可行性;同時(shí)通過(guò)基因芯片和生物信息學(xué)技術(shù)研究EV71感

5、染過(guò)程中相關(guān)的信號(hào)通路，及與此相關(guān)的miRNA。我們希望通過(guò)本研究，可以進(jìn)一步闡明miRNA在EV71病毒誘導(dǎo)的手足口病的致病機(jī)制，并為EV71病毒的預(yù)防與治療提供借鑒價(jià)值。
　　方法:
　　一、MSC細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定
　　1.Huc-MSC細(xì)胞的體外培養(yǎng)。
　　2.通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)MSC細(xì)胞的免疫表型。
　　二、EV71病毒滴度測(cè)定與細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)
　　1.采用Reed-Muench兩氏法計(jì)算EV7

6、1的TCID50和病毒滴度。
　　2.采用CCK-8試劑盒檢測(cè)以不同MOI的EV71進(jìn)行感染的MSC的細(xì)胞存活率。
　　三、基因芯片檢測(cè)
　　1.采用TRNzol法提取總RNA，mirVanaTMmiRNAIsolationKit純化總RNA。
　　2.采用甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性。
　　3.利用基因芯片技術(shù)檢測(cè)EV71病毒感染后相關(guān)mRNA、miRNA的變化。
　　四、生物信息學(xué)分析與

7、qRT-PCR
　　1.利用AgilentGeneSpring軟件分析基因芯片的熒光雜交圖。
　　2.利用qRT-PCR技術(shù)驗(yàn)證miR-6068、miR-575、miR-134-5p、miR-582-5p的表達(dá)變化
　　3.利用TargetScan、miRanda、PicTar和miRWalk四個(gè)生物信息學(xué)軟件對(duì)目的miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)。
　　4.利用DAVID基因注釋工具對(duì)異常表達(dá)的mRNA和目的miRNA

8、的靶基因進(jìn)行GO和KEGG分析。
　　結(jié)果:
　　1.經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)MSC細(xì)胞表面抗原，CD34和CD45分別為0.42％和0.06％，呈陰性表達(dá)，而CD44和CD90分別為98.96％和100％，呈陽(yáng)性表達(dá)。
　　2.通過(guò)Reed-Muench兩氏法計(jì)算EV71毒株的半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(Tissuecultureinfectivedose，TCID50)，經(jīng)計(jì)算該毒株TCID50=10-8.7/0.1ml，

9、病毒滴度為3.5×108PFU/ml。
　　3.CCK-8法檢測(cè)示:EV71對(duì)MSC有明顯的細(xì)胞毒作用，其細(xì)胞存活率隨著MOI的增高而降低。
　　4.利用基因芯片技術(shù)共發(fā)現(xiàn)異常表達(dá)的miRNA共76條，mRNA共24條。
　　5.qRT-PCR證實(shí)EV71感染后miR-6068和miR-575的表達(dá)量分別升高了48倍和11倍，而miR-134-5p和miR-582-5p則分別降低了16倍和15倍。
　　6.通過(guò)G

10、O分析，發(fā)現(xiàn)EV71病毒通過(guò)結(jié)合和催化的分子功能，干擾了代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、生物過(guò)程調(diào)控、免疫系統(tǒng)等生物過(guò)程，進(jìn)而影響了細(xì)胞、細(xì)胞部件、細(xì)胞器、細(xì)胞膜的功能;在KEGG分析中其主要涉及整合素β1、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)受體、粘著斑、PI3K-Akt等通路。
　　7.EV71病毒與整合素β1的相互作用可以通過(guò)miR-6068、miR-575、miR-134-5p、miR-582-5p進(jìn)行調(diào)控。
　　結(jié)論:
　　MSC細(xì)胞對(duì)EV