缺血性腦卒中后提高BMSCs移植存活率及其療效途徑與機制探討.pdf

1、目的:干細胞移植一直是諸多腦損傷疾病（包括腦卒中）治療應用的研究熱點，但其移植后的活力及其功能效率低下是干細胞治療效果不佳的主要原因之一。缺氧誘導因子-1α（Hypoxia-Inducible-Factor-1-alpha，HIF-1α）是細胞處于低氧環(huán)境狀態(tài)下的一個較敏感分子。HIF-1α可以影響腫瘤細胞的增殖、凋亡，而關于HIF-1α對干細胞特別是骨髓間充質干細胞(Bone marrow mesenchymal stem cells

2、，BMSCs)移植治療腦卒中的療效影響及機制尚鮮見報道。本課題通過在BMSCs細胞中過表達HIF-1α，研究HIF-1α對BMSCs存活的影響以及是否可以提高BMSCs移植后的活力及其功能效率，探討影響B(tài)MSCs移植治療腦卒中療效的相關因素及相應機制。
　　方法:本研究分為體外實驗和體內實驗。體外實驗中，以CD29、CD90、CD105、CD45為主要標志物，通過流式細胞術鑒定BMSCs;用HIF-1α綠色熒光蛋白（HIF-1α-

3、green fluorescent protein，HIF-1α-GFP）慢病毒載體感染BMSCs，并將BMSCs置于氧-糖剝奪(oxygen-glucose deprivation，OGD)條件下(37℃恒溫，以體積比50mL CO2/L+950mL N2/L混合氣充氣30min，用于平衡pH值），無氧無糖培養(yǎng)BMSCs2h;采用四甲基偶氮唑鹽比色法(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)法檢測BMSCs細

4、胞存活率、流式細胞術和TUNEL法檢測細胞凋亡情況、電鏡檢測BMSCs細胞自噬的超微結構、Western Blot檢測HIF-1α、凋亡和自噬相關蛋白的表達;使用腺苷酸活化蛋白激酶[Adenosine5'-monophosphate(AMP)-activated protein kinase，AMPK]的選擇性抑制劑即Compound C阻斷信號通路，檢測HIF-1α過表達是否通過激活AMPK、抑制哺乳動物雷帕霉素靶（mammalian

5、 target of rapamycin，mTOR）信號通路而起到調控凋亡和自噬的作用。體內實驗中，將HIF-1α過表達的BMSCs移植到大腦中動脈閉塞模型(Middle Cerebralartery Occlusion，MCAO)大鼠左側紋狀體內，采用熒光顯微鏡觀察GFP陽性細胞率，氯化三苯基四氮唑(triphenyl tetrazolium chloride，TTC)染色法檢測大鼠顱腦梗死體積，改良大鼠神經功能缺損評分(modifi

6、ed neurological severity score，mNSS)評估BMSCs移植后的大鼠的神經功能，Western Blot檢測BMSCs移植后相關細胞因子的變化。
　　結果:體外實驗中，流式細胞術鑒定BMSCs表面標志物的表達結果:其中CD29(96.72％)、CD90(98.53％)、CD105(98.99％)陽性表達;CD45(0.53％)陰性表達。qRT-PCR檢測結果顯示HIF-1α-GFP在BMSCs細胞中穩(wěn)

7、定轉染，與對照組相比，HIF-1α的mRNA和蛋白水平明顯升高。MTT、TUNEL和流式結果顯示:細胞在OGD條件下BMSCs存活率顯著降低，細胞凋亡明顯增加，而上調BMSCs細胞中HIF-1α的表達可以顯著增強BMSCs的細胞存活率，抑制細胞凋亡。在OGD誘導后凋亡蛋白Caspase-9、Bax的蛋白表達上調，抗凋亡蛋白Bcl-2，Bcl-xl的蛋白表達下調。在OGD條件下，HIF-1α過表達可抑制Caspase-9和Bax的表達，促

8、進Bcl-2，Bcl-xl的表達。電鏡檢測顯示:在OGD誘導后，在HIF-1α過表達的BMSCs細胞中觀察到較多的自噬體和自體溶酶體，并且HIF-1α過表達促進了LC3-Ⅱ和Beclin1蛋白的表達，抑制了P62蛋白的表達。為進一步探索HIF-1α調控BMSCs調控凋亡和自噬的機制，Western Blot檢測發(fā)現(xiàn):HIF-1α促進了OGD處理后細胞AMPK蛋白的磷酸化，并對mTOR磷酸化則產生抑制作用，而AMPK磷酸化抑制劑compo

9、und C逆轉了HIF-1α對mTOR磷酸化的抑制作用。體內實驗中，相較于正常的BMSCs移植組，HIF-1α過表達的BMSCs移植組GFP陽性率升高，腦梗塞體積縮小更明顯，mNSS評分更佳，腫瘤壞死因子-a（tumor necrosis factor-a，TNF-α）、白介素1β(interleukin1β，IL1β)、IL-6炎性因子表達減少，腦源性神經營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，B