GCA-HIF-1α-GCC提高移植骨髓干細胞存活率及治療缺血性心肌病的實驗研究.pdf

1、近年來，隨著干細胞工程的興起，骨髓間充質干細胞在治療缺血性心臟病方面?zhèn)涫荜P注。研究表明，干細胞可以分化為心肌細胞、增加有功能的心肌細胞數(shù)量，增加心梗區(qū)域血管的密度，改善心功能，干細胞的存活依賴于所種植的微環(huán)境，移植到缺血心肌的干細胞存活率極低，嚴重制約了其療效。實驗證實低氧誘導因子—1α（hypoxia—inducible factor1α，HIF—1α）能明顯抑制細胞的凋亡，雖然缺氧心肌能夠產(chǎn)生HIF—1α，但由于降解極快，難以在心肌

2、缺血缺氧中發(fā)揮作用。因此我們運用雙定點基因突變的方法重組HIF—1α，轉染干細胞，研究在體內(nèi)外的缺氧條件下，基因突變的HIF—1α能否抑制干細胞的凋亡，提高治療效果，并在此基礎上進一步探討干細胞自體移植聯(lián)合基因轉染治療缺血性心肌病的機理。 第一部分 豬骨髓間充質干細胞（MSCs）的分離、培養(yǎng)和心梗模型的建立 目的：從豬的骨髓中分離出具有多向分化潛能的骨髓間充質干細胞（Mesenchymal Stem Cells，MSCs

3、）以及建立豬的心梗動物動物模型。 第一節(jié) 豬骨髓間充質干細胞（MSCs）的分離、培養(yǎng) 目的：建立豬骨髓間充質干細胞體外培養(yǎng)方法，為細胞心肌成形術提供新材料。 方法：豬的骨髓MSCs分離純化后，流式細胞儀檢測細胞周期。 結果：體外培養(yǎng)的原代MSCs10～14d達到融合，細胞周期顯示73%的細胞處于G0/G1期。 結論：根據(jù)黏附特性分離的豬骨髓MSCs在體外條件下可生長擴增，可用于細胞心肌成形術。

4、 第二節(jié) 豬心肌梗死模型的建立 目的：經(jīng)心導管用明膠海綿栓子栓塞豬的冠狀動脈左前降支（LAD），建立心肌梗死的模型。 方法：麻醉后經(jīng)股動脈置入心導管至冠狀動脈左前降支遠端用明膠海綿栓塞LAD。8周后行血流動力學、核磁共振、冠狀動脈造影及組織學檢查。 結果：與對照組相比，心梗（MI）組左室發(fā)展壓（LVDP）降低（P<0.05），±dp/dtmax下降（P<0.05）。與對照組相比，心梗（MI>組左室每搏量（SV

5、）、舒張末期室壁厚度（EDWT）下降（P<0.05）。復查冠脈造影提示LAD栓塞仍存在。組織學檢查MI組前室壁、室間隔形成了透壁梗死灶。 結論：運用明膠海綿封堵冠狀動脈成功建立豬心肌梗死模型，符合臨床病理生理過程，穩(wěn)定可靠。 第二部分 pcDNA3.1+—GCA—HIF—1α—GCC慢病毒表達載體構建 目的：構建低氧誘導因子—1α（hypoxia inducible factor—1，HIF—1α）真核表達載體p

6、cDNA3.1+—HIF—1α的突變體pcDNA3.1+—GCA—HIF—1α—GCC，并用慢病毒包裝。 方法：用定點突變的方法將pcDNA3.1+—HIF1α的HIF1α第567位脯氨酸HIF1αPro密碼子CCA突變?yōu)楸彼幔ˋla）密碼子GCA，構建成單個突變HIF1α真核表達載體pcDNA3.1+HIF1α—567A1α在第一次突變的基礎上仍然用定點突變的方法將pcDNA3.1+—HIF1α—567A1α的第811位天冬

7、酰胺（Asn）密碼子AAT突變?yōu)楸彼幔ˋla）密碼子GCC，構建成雙定點突變HIF1α真核表達載體pcDNA3.1+—GCA—HIF—1α—GCC，重組成HIF1α慢病毒質粒，經(jīng)酶切及測序鑒定正確后，在293細胞中包裝成為重組HIF1α慢病毒，并進行PCR鑒定及滴度測定，以RT—PCR和Western blot法分別對轉染細胞進行表達分析。 結果：經(jīng)酶切鑒定及基因測序證實人雙突變型低氧誘導因子1α真核表達載體GCA—HIF—1

8、α—GCC構建成功，PCR檢測重組慢病毒包裝成功，病毒滴度為2.5×108tu/ml. 結論：成功構建慢病毒包裝重組人雙突變型低氧誘導因子1α真核表達載體GCA—HIF—1α—GCC，能穩(wěn)定表達相應的蛋白和HIF—1αmRNA。 第三部分 慢病毒系統(tǒng)介導的GCA—HIF—1α—GCC基因轉染豬骨髓干細胞及凋亡檢測 目的：觀察慢病毒包裝系統(tǒng)（pPACKHl—Lentivector Packaging Kit）介導的

9、GCA—HIF—1α—GCC基因轉染豬MSCs，細胞內(nèi)GCA—HIF—1α—GCC表達情況以及對MSCs生長的影響，在低氧的環(huán)境中檢測轉GCA—HIF—1α—GCC基因的骨髓干細胞和原代細胞、轉慢病毒空載體細胞的凋亡情況。 方法：取生長良好的第2代MSCs接種，培養(yǎng)至生長匯合70—80%時，加入慢病毒載體GCA—HIF—1α—GCC，設定轉染復數(shù)（multiplicities of infection，MOI）為5，以只含GFP

10、基因的空質粒進行對照。熒光顯微鏡觀察綠色熒光。提取蛋白后進行westernblot蛋白鑒定。用FITC—Annexin V和PI雙染法行流式細胞儀分析比較MSCs凋亡，轉慢病毒空載體的MSCs和轉GCA—HIF—1α—GCC的MSCs三種細胞在1% O237℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后細胞的凋亡和死亡情況。Western blot檢測Bax、HO—1蛋白表達。 結果：轉染MSCs48小時后，可檢測到強熒光出現(xiàn)。Western bl

11、ot免疫印跡技術表明HIF—1α蛋白表達產(chǎn)物的分子量與已知分子量相符。原代細胞在缺氧和乏營養(yǎng)狀態(tài)下發(fā)生大量的凋亡，其凋亡率為61.3%，轉空載體的細胞死亡率達67.3%，而轉GCA—HIF—1α—GCC基因的MSC的凋亡率僅為7.1%。Western blot表明轉基因的MSCs，HO—1蛋白表達增高而Bax表達降低。 結論：使用攜帶目的基因GCA—HIF—1α—GCC的慢病毒系統(tǒng)轉染豬的骨髓干細胞可使其穩(wěn)定表達HIF—1α。轉

12、GCA—HIF—1α—GCC的MSCs在體外較MSCs更能耐受缺氧和乏營養(yǎng)所誘發(fā)的凋亡，其原因與HIF—1α穩(wěn)定表達促使干細胞分泌HO—1抑制Bax有關。 第四部分 GCA—HIF—1α—GCC修飾自體骨髓干細胞移植治療缺血性心肌病的實驗研究 目的：探討轉染GCA—HIF—1α—GCC基因的MSCs自體移植治療缺血性心肌病的療效及機理，為治療缺血性心肌病提供新的方法。 方法：選用15～20kg梅山小型豬24頭，隨

13、機分4組：A組：空白組、B組：DMEM組、C組：MSCs組和D組：轉基因組，應用明膠海綿栓塞LAD建立心梗模型。采用密度梯度離心與貼壁篩選相結合的方法分離純化、體外擴增MSCs，D組MSCs體外轉染GCA—HIF—1α—GCC基因。干細胞（1×107/5 mL）經(jīng)心導管注射到LAD栓塞處遠端。分別于MSCs注射1周、2周、4周、6周和8周，行Powerlab及MRI檢查，評估心功能和活體內(nèi)干細胞標記情況，采用ELISA法檢測血漿BNP、

14、VEGF在梗死后和干細胞移植前后的變化；組織學觀察各組移植細胞的情況，測算心梗面積，以及Western blot檢測過氧化酶體增殖物激活型受體a（peroxisomeproliferator activated receptorα，PPARα）。 結果：移植前，磁共振示梗死心臟的左室舒張末徑（EDWT）增加，每搏量（SV）明顯下降，血流動力學LVDP、±dp/dtmax下降明顯。移植后，C、D組的心功能較移植前有改善（P<0.0

15、5），移植的MSCs能防止梗塞區(qū)變薄和擴張：與A、B兩組和移植前相比，梗死區(qū)的收縮功能和血流灌注均有所改善（P<0.05），移植組的心梗面積縮?。≒<0.05）；這種心功能的改善在D組更為明（與C組比較，P<0.05）。Western blot檢測PPAR、原位雜交檢測AKT蛋白表達顯示，與A、B和C組相比，D組PPARα蛋白表達明顯增加（P<0.05）。D組的增加比C組顯著。與A、B兩組相比，C、D組梗死區(qū)的毛細血管密度明顯增加（P<

16、0.05>，D組的增加比C組顯著，同樣比較，BNP降低明顯（P<0.05），D組的降低比C組顯著。C、D組VEGF的水平在梗死后有所增加，在細胞移植后一周出現(xiàn)高峰，后逐漸下降。 結論：MSCs能在宿主心肌組織中存活，通過防止梗死區(qū)變薄、抑制收縮功能異常而改善左室功能。GCA—HIF—1α—GCC轉染MSCs可以使移植的干細胞更能耐受移植早期的缺氧和乏營養(yǎng)的微環(huán)境，減少細胞的凋亡，增加參與心肌修復的干細胞的絕對數(shù)量，從而可更加顯著