全基因組DNA甲基化參與胃癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制研究.pdf

1、胃癌是嚴(yán)重危害我國(guó)居民身心健康的常見(jiàn)消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，由于缺乏早期、特異、敏感的篩查和診斷指標(biāo)，給胃癌的早期診斷和治療帶來(lái)極大的困難和挑戰(zhàn)。因此，加強(qiáng)對(duì)胃癌病因?qū)W、發(fā)病機(jī)制及預(yù)后因素的研究，篩選可靠的可用于預(yù)測(cè)胃癌發(fā)病及預(yù)后的生物標(biāo)志物，對(duì)今后胃癌的預(yù)防、干預(yù)、治療和預(yù)后判斷均具有重要的意義。
　　胃癌的發(fā)生發(fā)展及臨床轉(zhuǎn)歸是涉及遺傳和表觀遺傳改變所致細(xì)胞調(diào)節(jié)和生長(zhǎng)失控的多階段復(fù)雜過(guò)程，是環(huán)境因素和遺傳因素共同作用的結(jié)果。大量的

2、流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)表明，幽門螺桿菌（Helico bacter pylori，HP）感染、飲食因素（高鹽、含N-亞硝基化合物、新鮮蔬菜和水果攝入不足）、吸煙、肥胖、家族遺傳史等都與胃癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)。各種環(huán)境危險(xiǎn)因素在不同階段作用于不同基因，引起表觀遺傳的改變，繼而導(dǎo)致相關(guān)基因活性和表達(dá)水平的改變，這些基因環(huán)境之間的交互作用，最終導(dǎo)致胃癌的發(fā)生發(fā)展。機(jī)體參與環(huán)境應(yīng)答的關(guān)鍵調(diào)控之一是基因組調(diào)控區(qū)域的甲基化，基因啟動(dòng)子區(qū)的CpG島的甲基化

3、在調(diào)控基因表達(dá)方面發(fā)揮重要作用，但是在全基因組水平揭示DNA異常甲基化參與胃癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制的研究目前還很匱乏，而且基因調(diào)控區(qū)的異常甲基化參與胃癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制并沒(méi)有被完全闡明。此外，位于基因調(diào)控區(qū)CpG島的遺傳變異(主要是單核苷酸多態(tài)性，SNP)是否可以調(diào)控表觀遺傳效應(yīng)，共同參與胃癌的發(fā)生和臨床轉(zhuǎn)歸還有待進(jìn)一步研究。本研究擬在全基因組水平探討表觀遺傳機(jī)制，以及遺傳與表觀遺傳的交互效應(yīng)參與胃癌發(fā)生發(fā)展以及預(yù)后的分子機(jī)制，以期為胃癌的

4、早期預(yù)防、病因?qū)W研究以及預(yù)后判斷提供基礎(chǔ)研究證據(jù)。
　　第一部分高甲基化基因KCNMA1通過(guò)調(diào)控PTK2參與胃癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制研究
　　研究背景：
　　基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化在調(diào)控基因表達(dá)方面發(fā)揮重要作用，由于啟動(dòng)子高甲基化導(dǎo)致的抑癌基因失活，在多種腫瘤發(fā)生發(fā)展中扮演重要的角色。但是在全基因組水平揭示DNA異常甲基化參與胃癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究目前還很匱乏，所以在全基因組水平揭示胃癌發(fā)生過(guò)程中的甲基化水平差異顯得尤為必要和

5、迫切。
　　研究方法：
　　本研究收取12位胃癌患者的癌組織及其癌旁正常組織，提取組織DNA，亞硫酸鹽修飾后，采用Illumina Human甲基化450K芯片檢測(cè)胃癌患者癌與癌旁組織全基因組的甲基化水平差異，并采用甲基化特異性PCR(methylation-specificPCR，MSP)和亞硫酸鹽測(cè)序法(bisulphite sequencing，BSP)的方法進(jìn)一步驗(yàn)證特異性CpG島在癌和癌旁的甲基化水平差異，然后通過(guò)

6、生物信息學(xué)，細(xì)胞表型實(shí)驗(yàn)，以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探索目的基因KCNMA1與下游靶基因之間的調(diào)控關(guān)系，最后使用Kaplan-Meier生存曲線評(píng)估KNMA1啟動(dòng)子高甲基化對(duì)于胃癌預(yù)后的影響。
　　研究結(jié)果：
　　系統(tǒng)分析芯片結(jié)果發(fā)現(xiàn)，位于基因KCNMA1啟動(dòng)子區(qū)的CpG位點(diǎn)cg24113782具有最顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.006)，cg24113782參與調(diào)控基因KCNMA1在胃癌組織和胃癌細(xì)胞中的表達(dá)沉默。進(jìn)一步在112對(duì)組織中驗(yàn)證

7、發(fā)現(xiàn)，癌組織中KCNMA1基因啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生甲基化的比例為66.7％(77/112)，而癌旁中發(fā)生甲基化的比例僅為16.2％(18/112)，生存分析提示KCNMA1啟動(dòng)子區(qū)的高甲基化預(yù)示胃癌患者不良的預(yù)后結(jié)局(P=0.036)。體外實(shí)驗(yàn)表明在胃癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)KCNMA1表達(dá)質(zhì)粒能明顯抑制細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等惡性表型(P＜0.001)，采用流式細(xì)胞儀研究發(fā)現(xiàn)KCNMA1主要是通過(guò)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的惡性表型;裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)也

8、發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)KCNMA1能明顯抑制腫瘤細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的增殖，過(guò)表達(dá)KCNMA1的瘤體生長(zhǎng)速度明顯下降(P＜0.001)。進(jìn)一步的研究我們發(fā)現(xiàn)KCNMA1發(fā)揮抑癌效應(yīng)，主要是通過(guò)降低FAK凋亡通路促癌基因PTK2的表達(dá)，進(jìn)而影響胃癌細(xì)胞凋亡進(jìn)程實(shí)現(xiàn)的。
　　研究結(jié)論：
　　本項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)胃癌組織中啟動(dòng)子區(qū)異常高甲基化基因KCNMA1通過(guò)調(diào)控PTK2的表達(dá)參與胃癌的發(fā)生發(fā)展，它的啟動(dòng)子區(qū)高甲基化是預(yù)測(cè)胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)。<

9、br>　　第二部分基于全基因組的DNA甲基化相關(guān)SNPs(CpG-SNPs)與胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)及其機(jī)制研究
　　研究背景：
　　大量的研究已經(jīng)證實(shí)位于基因組DNA上的SNPs可以影響其本身或者附近CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)，導(dǎo)致攜帶不同等位基因的個(gè)體，SNPs所在宿主CpG島甲基化水平的差異。SNPs可能通過(guò)改變其所在CpG島的甲基化狀態(tài)，干擾轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，進(jìn)而影響下游基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。因此，在全基因組水平探討

10、遺傳變異與表觀遺傳的交互效應(yīng)，能夠?yàn)榻沂疚赴┌l(fā)生風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)SNPs位點(diǎn)的生物學(xué)功能開(kāi)辟新的研究思路。
　　研究方法：
　　本研究結(jié)合胃癌全基因組關(guān)聯(lián)研究(genome-wide association study，GWAS)的數(shù)據(jù)，并通過(guò)ENCODE（encyclopedia of DNA elements）數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得全基因組內(nèi)的所有CpG島的基因組物理位置，采用Illumina660W Quad chip對(duì)這個(gè)區(qū)域內(nèi)的所有

11、SNPs進(jìn)行基因分型，并采用一系列分子生物學(xué)方法，探索顯著關(guān)聯(lián)SNPs調(diào)控其宿主CpG島的甲基化水平的分子機(jī)制，以及相關(guān)基因的分子功能。
　　研究結(jié)果:
　　首先對(duì)所有CpG島內(nèi)的SNPs進(jìn)行基因分型，并計(jì)算其OR值和95％CI，采用Bonferroni校正后，發(fā)現(xiàn)位于假基因(pseudogene) GBAP1啟動(dòng)子區(qū)的遺傳變異rs2990245與胃癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)，在顯性模型中，相對(duì)于攜帶TT基因型的個(gè)體，攜帶CT和C

12、C基因型的個(gè)體罹患胃癌的風(fēng)險(xiǎn)減少20％(OR=0.80，95％CI=0.68-0.94，P=0.0076);隱性模型的結(jié)果也發(fā)現(xiàn)相對(duì)于攜帶TT和CT基因型的個(gè)體，攜帶CC基因型者發(fā)生胃癌的風(fēng)險(xiǎn)顯著降低(OR=0.40，95％CI=0.24-0.65，P=0.0002)。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)rs2990245可以通過(guò)影響GBAP1的啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài)，進(jìn)而調(diào)控GBAP1的表達(dá)。雙熒光實(shí)驗(yàn)表明，rs2990245T等位基因的轉(zhuǎn)錄活性明顯高于C

13、等位基因。此外，我們發(fā)現(xiàn)GBAP1在胃癌中顯著高表達(dá)，并且其在細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)明顯高于核內(nèi)的表達(dá)。更進(jìn)一步的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)GBAP1可以扮演“內(nèi)源競(jìng)爭(zhēng)性RNA”(competing endogenous RNAs，ceRNA)的角色，通過(guò)和其同源基因GBA競(jìng)爭(zhēng)吸附miR-212-3p，解除miR-212-3p對(duì)GBA的抑制效應(yīng)，上調(diào)基因GBA的表達(dá)。表達(dá)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，GBAP1與GBA在胃癌組織中的表達(dá)呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)，且其表達(dá)相關(guān)性也被