高溫誘導(dǎo)對羅非魚全基因組甲基化水平的影響研究.pdf

1、尼羅羅非魚是一種性別分化方向受到基因和溫度同時(shí)調(diào)控的魚類，即在尼羅羅非魚的性別分化期，溫度能夠?qū)ζ湫詣e分化的方向起到一定的導(dǎo)向作用，而溫度是如何影響其性別分化的，具體的分子機(jī)制是什么，目前還不是很清楚。Cyp19a1a基因，編碼的芳香化酶，是雄激素轉(zhuǎn)變?yōu)榇萍に氐南匏倜?，在尼羅羅非魚性別分化期起關(guān)鍵性作用，它能夠決定尼羅羅非魚的性別分化的方向。表觀遺傳學(xué)是近年來研究的熱點(diǎn)，一些表觀遺傳機(jī)制如DNA甲基化和組蛋白甲基化都能影響基因的表達(dá)，甚

2、至能夠影響魚類的性別分化方向。表觀遺傳機(jī)制是如何介導(dǎo)尼羅羅非魚的性別分化過程和相關(guān)基因的表達(dá)的，而高溫誘導(dǎo)又在其中扮演了什么角色，這是一個(gè)有待研究的問題。本研究中，對進(jìn)入熱敏期的尼羅羅非魚幼魚進(jìn)行36℃高溫誘導(dǎo)，誘導(dǎo)12天后養(yǎng)至4月齡采樣，分別提取對照雌魚CF、對照雄魚CM、誘導(dǎo)雌魚IF、誘導(dǎo)雌魚IM的DNA后進(jìn)行MeDIP-seq高通量測序，研究高溫誘導(dǎo)對尼羅羅非魚全基因組甲基化水平的影響。鑒于cyp19a1a在羅非魚性別分化中的重要

3、作用，本文分析了高溫誘導(dǎo)對羅非魚cyp19a1a基因啟動子區(qū)甲基化水平和mRNA表達(dá)水平的影響，并采用ChIP分析了高溫誘導(dǎo)對組蛋白甲基化水平的影響。同時(shí)，亞硫酸氫鹽測序(BSP)檢測不同年齡段羅非魚cyp19a1a基因啟動子區(qū)甲基化水平和qRT-PCR技術(shù)分析相應(yīng)的mRNA表達(dá)量變化。主要結(jié)果如下:
　　采用MeDIP-seq技術(shù)，對高溫組和對照組的雌雄尼羅羅非魚的全基因組甲基化水平進(jìn)行測序分析，4個(gè)組(對照雌魚CF、對照雄魚C

4、M、誘導(dǎo)雌魚IF、誘導(dǎo)雄魚IM)分別獲得100 bp大小長度的128055474、50323361、69696162、75132883個(gè)raw data，四個(gè)組共含有16.15Gb的raw reads;其中含有105101871、47468675、55024475、67759606個(gè)clean data，分別占raw data的82.08％、92.33％、78.95％、90.19％，共13.75Gb。四個(gè)組分別有105101871、47

5、468675、55024475、67759606個(gè)reads比對到尼羅羅非魚的全基因組上，其中有49917355、22480291、26099799、32506902個(gè)特異reads，占所有比對到基因組上reads的47.49％、47.36％、47.43％、47.97％。四組間兩兩比較，各比較組甲基化水平上下調(diào)基因數(shù)分別為:CF/CM上調(diào)基因344個(gè)，下調(diào)基因661個(gè);IF/IM上調(diào)基因331個(gè)，下調(diào)基因215個(gè);IF/CF上調(diào)基因24

6、8個(gè)，下調(diào)基因126個(gè);IM/CM上調(diào)基因568個(gè)，下調(diào)基因680個(gè)。并從這些基因中篩選出了四個(gè)性別分化相關(guān)基因采用qRT-PCR驗(yàn)證其mRNA表達(dá)量，結(jié)果顯示這些基因mRNA表達(dá)量的變化趨勢與甲基化水平的變化相符合。總體來講，MeDIP-seq結(jié)果顯示高溫誘導(dǎo)能夠一定程度上影響尼羅羅非魚全基因組甲基化水平。
　　亞硫酸氫鹽測序結(jié)果顯示，經(jīng)高溫誘導(dǎo)后，雌雄尼羅羅非魚cyp19a1a基因啟動子區(qū)甲基化水平都有所上升，并且該基因的mR

7、NA表達(dá)量也顯著下降，高溫組和對照組間均差異顯著(P＜0.05)，這說明高溫誘導(dǎo)能夠顯著升高雌雄尼羅羅非魚cyp19a1a啟動子區(qū)的甲基化水平，降低其表達(dá)量。
　　染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)檢測了高溫誘導(dǎo)對尼羅羅非魚cyp19a1a基因組蛋白H3K9的甲基化水平的影響，結(jié)果顯示，高溫誘導(dǎo)能顯著升高雄性尼羅羅非魚組蛋白H3K9的甲基化水平，并且募集到的RNA聚合酶的量顯著下降，暗示了高溫誘導(dǎo)能通過影響組蛋白甲基化顯著降低雄性尼羅羅

8、非魚cyp19a1a基因的轉(zhuǎn)錄程度。
　　亞硫酸氫鹽測序結(jié)果顯示雌性尼羅羅非魚隨著年齡的增長，cyp19a1a基因啟動子區(qū)甲基化程度逐漸下降，qRT-PCR結(jié)果顯示該基因的mRNA表達(dá)量逐漸上升;而雄魚的甲基化程度則是呈現(xiàn)上升趨勢，mRNA表達(dá)量逐漸下降。各年齡段間甲基化水平和mRNA表達(dá)量均差異顯著(P＜0.05)。表明隨著年齡的增長，雌性尼羅羅非魚對cyp19a1a表達(dá)產(chǎn)物芳香化酶的需求量逐漸上升，而雄魚的則呈下降趨勢。