Nothc1在體外誘導(dǎo)胃腺癌細(xì)胞凋亡及其作用機(jī)制研究.pdf

1、胃癌(Gastric carcinoma)是常見(jiàn)惡性腫瘤之一。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)都涉及到基因的改變，其中包括原癌基因的激活以及抑癌基因的失活等。因此，研究與癌癥相關(guān)的基因可以為診斷、治療和防止癌癥復(fù)發(fā)提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。在眾多與腫瘤相關(guān)基因中，Notch途徑與腫瘤的密切關(guān)系引起關(guān)注。
　　 自從二十世紀(jì)初在果蠅中發(fā)現(xiàn)Notch基因--因其部分突變可在果蠅翅膀的邊緣造成缺口而得名。大量的研究表明，Notch信號(hào)

2、途徑在細(xì)胞增殖、分化和凋亡中起著重要的作用。當(dāng)發(fā)現(xiàn)急性T淋巴細(xì)胞白血病發(fā)生與Notch受體有關(guān)時(shí)，Notch與腫瘤的關(guān)系受到關(guān)注。當(dāng)配體與受體結(jié)合后，Notch受體經(jīng)酶切水解釋放其胞內(nèi)段(NICD)，即Notch受體的活性形式。隨后，NICD轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，與轉(zhuǎn)錄因子CSL結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控下游基因的表達(dá)。
　　 前期研究得出了不同結(jié)果：Notch1在腫瘤中可能是癌基因，也可能是抑癌基因。這種結(jié)果的不一致可能與細(xì)胞的種類(lèi)特性有關(guān)。本

3、實(shí)驗(yàn)證明了Notch1在胃癌發(fā)生發(fā)展中起著抑癌基因的作用。Notch1可以顯著地抑制胃腺癌BGC823細(xì)胞的體內(nèi)外增殖作用。這種抑制作用與Notch1上調(diào)P21和下調(diào)Cyclin D1的表達(dá)有直接的關(guān)系，并使細(xì)胞周期受阻滯于G1期。Notch1通過(guò)上調(diào)Caspase-3和Bax以及下調(diào)Bcl-2，使BGC823細(xì)胞凋亡。
　　 方法：
　　 1、免疫組織化學(xué)方法染色采用EnVision方法對(duì)胃癌及胃正常組織進(jìn)行免疫組織化

4、學(xué)染色2、細(xì)胞培養(yǎng)(1)傳代培養(yǎng)GES-1：含有10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，37℃5% CO2飽和濕度。
　　 (2)傳代培養(yǎng)胃癌BGC823、SGC-7901和AGS細(xì)胞株：含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，37℃5% CO2飽和濕度。
　　 3、MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力(1)比較人胃正常粘膜細(xì)胞GES-1與胃癌細(xì)胞BGC823、SGC7901和AGS增殖能力。
　　 (2)檢測(cè)活化Notch1對(duì)

5、BGC823增殖能力影響。
　　 4、Real-time RT PCRReal-time RT PCR比較Notch1在GES-1與胃癌細(xì)胞BGC823、SGC7901和AGS中mRNA表達(dá)水平5、Western blot分析(1)檢測(cè)Notch1在GES-1與胃癌細(xì)胞BGC823、SGC7901和AGS蛋白質(zhì)表達(dá)水平。
　　 (2)鑒定穩(wěn)定表達(dá)NICD的BGC823-NICD細(xì)胞株。
　　 (3)活化Notch

6、1對(duì)凋亡途徑和細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。
　　 6、流式細(xì)胞儀檢測(cè)Notch1對(duì)細(xì)胞凋亡的影響7、流式細(xì)胞儀檢測(cè)Notch1對(duì)細(xì)胞周期的影響8、裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Notch1對(duì)BGC823體外增殖能力的影響結(jié)果1、Notch1在胃癌中表達(dá)下調(diào)(1)Notch1的表達(dá)定位于細(xì)胞漿和細(xì)胞膜，在胃癌組織和正常胃組織中表達(dá)的陽(yáng)性率分別為38.9%(42/108)和72.7%(16/22)，差異有顯著性(p<0.01)。Notch1表達(dá)與

7、腫瘤的分化程度、浸潤(rùn)深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(p<0.05)。Notch1的表達(dá)與腫瘤的大小無(wú)關(guān)(p>0.05)。
　　 (2)Real-time RT RCR和western blot結(jié)果顯示 Notch1 mRNA在GES-1和各胃癌細(xì)胞系均有表達(dá)，與GES-1相比較，Notch1 mRNA在AGS、SGC-7901和BGC-823的表達(dá)分別為65%，59%和61%。具有顯著性差異(p<0.01)；三種胃癌細(xì)胞系Notch1 m

8、RNA表達(dá)組間差異無(wú)顯著性(p>0.05)。與GES-1比較，Notch1在AGS、SGC-7901及BGC-823細(xì)胞中蛋白質(zhì)水平的表達(dá)分別是57.2%，47.9%和60.0%，差異具有顯著性(p<0.01)，三種胃癌細(xì)胞系Notch1蛋白表達(dá)組間差異無(wú)顯著性(p>0.05)。
　　 2、MTT法檢測(cè)MTT結(jié)果顯示，AGS、SGC-7901和BGC-823胃癌細(xì)胞的增長(zhǎng)速度均明顯高于GES-1細(xì)胞株(p<0.05)，其中又以B

9、GC-823的增長(zhǎng)速度最快，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。
　　 3、活化的Notch1抑制BGC823細(xì)胞體內(nèi)外增殖MTT和裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Notch1能抑制胃癌BGC823細(xì)胞體內(nèi)外增殖。
　　 4、活化的Notch1能阻滯細(xì)胞周期與BGC823(53.23%)和BGC823-pcDNA(54.41%)比較，BGC823-NICD處于G1期細(xì)胞(68.72%)明顯增多，相對(duì)于BGC(34.54%)和BGC8

10、23-pcDNA(31.31%)，BGC823-NICD的S期細(xì)胞(21.79%)明顯降低，western blot結(jié)果顯示上調(diào)的P21和下調(diào)的Cyclin D1與Notch1誘導(dǎo)的細(xì)胞周期阻滯有關(guān)。
　　 5、活化Notch1誘導(dǎo)BGC823細(xì)胞凋亡BGC823-NICD細(xì)胞的凋亡率遠(yuǎn)大于BGC823、BGC823-pcDNA，說(shuō)明Notch1能顯著誘導(dǎo)BGC823細(xì)胞早期凋亡，Western blot結(jié)果顯示，BGC823細(xì)