PGE2上調(diào)THP-1巨噬細(xì)胞VEGF表達(dá).pdf

1、隨著生育年齡的推后，環(huán)境污染和生活壓力增大，不孕癥的發(fā)生率呈現(xiàn)一個(gè)上升的趨勢(shì)。本課題選取THP-1巨噬細(xì)胞及其促血管新生的作用作為切入點(diǎn)，通過研究THP-1巨噬細(xì)胞如何上調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)蛋白表達(dá)及其調(diào)控的機(jī)制探討其相關(guān)的促血管生成作用，為體外受精-胚胎移植(IVF-ET)反復(fù)著床失敗(RIF)的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　第一章 PGE2上調(diào)THP-1巨噬細(xì)胞VEGF表達(dá)的機(jī)制研究
　　第一節(jié) PGE2上調(diào)TH

2、P-1巨噬細(xì)胞VEGF表達(dá)
　　目的:
　　為了研究在女性生殖系統(tǒng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用的巨噬細(xì)胞是可能通過何種機(jī)制調(diào)節(jié)促血管生成的作用，我們采用了THP-1巨噬細(xì)胞進(jìn)行了體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)，通過Western Blot的方法檢測(cè)THP-1巨噬細(xì)胞內(nèi)促血管生成因子VEGF蛋白表達(dá)水平，初步探討PGE2能否促進(jìn)THP-1巨噬細(xì)胞合成VEGF的表達(dá)。
　　方法:
　　1.細(xì)胞培養(yǎng)和誘導(dǎo)
　　選取生長(zhǎng)良好的人單核細(xì)胞株THP

3、-1細(xì)胞， PMA誘導(dǎo)細(xì)胞貼壁形成典型的巨噬細(xì)胞即為THP-1巨噬細(xì)胞。
　　2.Westernblotting檢測(cè)PGE2對(duì)THP-1巨噬細(xì)胞株VEGF蛋白表達(dá)的影響。
　　選取狀態(tài)良好的THP-1巨噬細(xì)胞，分組為:空白處理組、1μmol/L PGE2組、10μmol/L PGE2組，處理THP-1巨噬細(xì)胞24小時(shí)后，提取細(xì)胞全蛋白，WesternBlot分析VEGF蛋白的表達(dá)。
　　3.SPSS20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)處

4、理分析，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多樣本均數(shù)比較應(yīng)用方差分析，方差齊選用LSD方法，方差不齊則用Duimett T3法，
　　結(jié)果:
　　與空白對(duì)照組相比，1μmol/L PGE2組THP-1巨噬細(xì)胞內(nèi)的VEGF蛋白表達(dá)明顯升高(P＜0.05);與與空白對(duì)照組相比，10μmol/L PGE2組THP-1巨噬細(xì)胞內(nèi)的VEGF蛋白表達(dá)明顯升高(P＜0.05);與1μmol/L PGE2組相比，10μmol/LPGE2組THP-1巨

5、噬細(xì)胞內(nèi)的VEGF蛋白表達(dá)亦有明顯升高(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　PGE2能有效上調(diào)THP-1巨噬細(xì)胞株VEGF蛋白的表達(dá)。并且，PGE2對(duì)THP-1巨噬細(xì)胞株VEGF蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用與呈濃度-梯度效應(yīng)。
　　第二節(jié) PGE2上調(diào)THP-1巨噬細(xì)胞VEGF表達(dá)的通路研究
　　目的:
　　采用了PGE2的特異性受體拮抗劑(EP2拮抗劑AH6809或EP4拮抗劑AH23848)或cAMP-PKA通路的

6、特異性抑制劑（腺苷酸環(huán)化酶抑制劑SQ22536或PKA抑制劑H89）預(yù)處理后再予PGE2刺激THP-1巨噬細(xì)胞，通過Western Blot的方法檢測(cè)THP-1巨噬細(xì)胞內(nèi)VEGF蛋白表達(dá)水平，進(jìn)一步探討PGE2調(diào)控THP-1巨噬細(xì)胞合VEGF表達(dá)的機(jī)制。
　　方法:
　　1.細(xì)胞培養(yǎng)和誘導(dǎo)
　　選取生長(zhǎng)良好的人單核細(xì)胞株THP-1細(xì)胞， PMA誘導(dǎo)細(xì)胞貼壁形成典型的巨噬細(xì)胞即為THP-1巨噬細(xì)胞。
　　2.Wes

7、ternblotting檢測(cè)PGE2上調(diào)THP-1巨噬細(xì)胞株VEGF蛋白表達(dá)的通路研究。
　　選取狀態(tài)良好的THP-1巨噬細(xì)胞，予PGE2的特異性受體拮抗劑（EP2拮抗劑AH6809或EP4拮抗劑AH23848）預(yù)處理后再予PGE2刺激THP-1巨噬細(xì)胞，提取細(xì)胞全蛋白，Western Blot分析VEGF蛋白的表達(dá)。
　　選取狀態(tài)良好的THP-1巨噬細(xì)胞，予cAMP-PKA通路的特異性抑制劑(腺苷酸環(huán)化酶抑制劑SQ2253

8、6或PKA抑制劑H89)預(yù)處理后再予PGE2刺激THP-1巨噬細(xì)胞，提取細(xì)胞全蛋白，Western Blot分析VEGF蛋白的表達(dá)。
　　3.SPSS20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)處理分析，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多樣本均數(shù)比較應(yīng)用方差分析，方差齊選用LSD方法，方差不齊則用Duimett T3法，P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　EP2拮抗劑能抑制PGE2對(duì)THP-1巨噬細(xì)胞株VEGF蛋白表達(dá)的上調(diào)作用，而E

9、P4則無影響。腺苷酸環(huán)化酶抑制劑SQ22536和PKA抑制劑H89均能抑制PGE2對(duì)THP-1巨噬細(xì)胞株VEGF蛋白表達(dá)的上調(diào)作用。
　　結(jié)論:
　　PGE2是通過EP2-cAMP-PKA通路調(diào)控THP-1巨噬細(xì)胞株VEGF蛋白的表達(dá)。
　　第二章 PGE2增強(qiáng)THP-1巨噬細(xì)胞促進(jìn)體外血管新生的影響
　　第一節(jié) PGE2影響THP-1巨噬細(xì)胞促進(jìn)HUVECs的遷移能力
　　目的:
　　上述實(shí)驗(yàn)初步證

10、明了PGE2通過EP2-cAMP-PKA通路調(diào)控THP-1巨噬細(xì)胞VEGF蛋白的表達(dá)，從而提示了PGE2可能是通過上調(diào)了THP-1巨噬細(xì)胞株的VEGF表達(dá)從而增強(qiáng)其促血管生成作用。因此我們采用了體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)—Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)和Matrigel體外成管實(shí)驗(yàn)，予不同處理THP-1巨噬細(xì)胞后，取細(xì)胞培養(yǎng)上清處理HUVECs，觀察HUVECs遷移的數(shù)目，驗(yàn)證PGE2是否可以影響THP-1巨噬細(xì)胞促進(jìn)HUVECs的遷移能力以及其影

11、響的可能機(jī)制。
　　方法:
　　1.細(xì)胞培養(yǎng)和誘導(dǎo)
　　選取生長(zhǎng)良好的人單核細(xì)胞株THP-1細(xì)胞， PMA誘導(dǎo)細(xì)胞貼壁形成典型的巨噬細(xì)胞即為THP-1巨噬細(xì)胞。
　　2.體外血管生成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PGE2對(duì)THP-1巨噬細(xì)胞株促進(jìn)HUVECs遷移能力的影響。
　　3.SPSS20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)處理分析，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多樣本均數(shù)比較應(yīng)用方差分析，方差齊選用LSD方法，方差不齊則用Duimett T3法，<

12、br>　　結(jié)果:
　　與空白對(duì)照組相比，1μmol/L PGE2組HUVECs遷移數(shù)目增多(P＜0.05);與空白對(duì)照組相比，10μmol/L PGE2組HUVECs遷移數(shù)目也明顯增多(P＜0.05);與1μmol/L PGE2組相比，10μmol/L PGE2組HUVECs遷移數(shù)目增多(P＜0.05);AH6809+ PGE2組的HUVECs遷移數(shù)目較10μmol/L PGE2組的少(P＜0.05)，AH23848+ PGE2的

13、HUVECs遷移數(shù)目與10μmol/L PGE2組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;SQ22536+ PGE2組和H89++ PGE2組的HUVECs遷移數(shù)目與10μmol/L PGE2組相比均減少(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　PGE2處理THP-1巨噬細(xì)胞后，能明顯增強(qiáng)HUVECs遷移的能力。其增強(qiáng)的能力與PGE2呈濃度-梯度效應(yīng)，這與Westernblot的結(jié)果相一致。EP2拮抗劑AH6809、腺苷酸環(huán)化酶抑制劑SQ22536和P

14、KA抑制劑H89均能抑制PGE2增強(qiáng)THP-1巨噬細(xì)胞能促進(jìn)HUVECs遷移能力，提示PGE2通過EP2和cAMP-PKA通路調(diào)控THP-1巨噬細(xì)胞增強(qiáng)HUVECs的遷移能力。
　　第二節(jié) PGE2影響THP-1巨噬細(xì)胞促進(jìn)HUVECs的體外成管能力
　　目的:
　　上述實(shí)驗(yàn)初步證明了PGE2通過EP2-cAMP-PKA通路調(diào)控THP-1巨噬細(xì)胞VEGF蛋白的表達(dá)，從而提示了PGE2可能是通過上調(diào)了THP-1巨噬細(xì)胞株

15、的VEGF表達(dá)從而增強(qiáng)其促血管生成作用。因此我們采用了Matrigel體外成管實(shí)驗(yàn)，予不同處理THP-1巨噬細(xì)胞后，取細(xì)胞培養(yǎng)上清處理HUVECs，觀察HUVECs的體外成管面積，驗(yàn)證PGE2是否可以影響THP-1巨噬細(xì)胞促進(jìn)HUVECs的體外成管能力以及其影響的可能機(jī)制。
　　方法:
　　1.細(xì)胞培養(yǎng)和誘導(dǎo)
　　2.體外血管生成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PGE2對(duì)THP-1巨噬細(xì)胞株促進(jìn)HUVECs體外成管能力的影響。
　　3.

16、SPSS20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)處理分析，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多樣本均數(shù)比較應(yīng)用方差分析，方差齊選用LSD方法，方差不齊則用Duimett T3法，
　　結(jié)果:
　　與空白對(duì)照組相比，1μmol/L PGE2組HUVECs成管面積增大(P＜0.05);與空白對(duì)照組相比，10μmol/L PGE2組HUVECs成管面積增大(P＜0.05);與1μmol/L PGE2組相比，10μmol/L PGE2組HUVECs成管面積也明顯增

17、大(P＜0.05); AH6809+ PGE2組的HUVECs成管面積較10μmol/L PGE2組的小(P＜0.05)，AH23848+PGE2的HUVECs成管面積與10μmol/L PGE2組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;SQ22536+ PGE2組和H89+ PGE2組的HUVECs遷移數(shù)目與10μmol/LPGE2組相比均減小(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　PGE2處理THP-1巨噬細(xì)胞后，能明顯增強(qiáng)HUVECs體外成管的