FM19G11增強惡性膠質(zhì)瘤細胞對替莫唑胺藥物敏感性的分子機制.pdf

1、目的：
　　腦膠質(zhì)瘤是最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤,大約占所有原發(fā)性腦腫瘤的45％，這也是癌癥患者死亡的主要原因之一。盡管標準治療方案包括手術(shù)完整切除、聯(lián)合放化療，但無進展生存期仍然很低，新診斷為膠質(zhì)母細胞瘤的患者的中位生存期只有12-15個月。新型烷化劑-替莫唑胺（temozolomide，TMZ）已經(jīng)確定為臨床標準的化療藥物，但是在治療過程中發(fā)現(xiàn)部分患者對化療并不敏感，所以這種現(xiàn)象嚴重阻礙了惡性膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后。限制替莫唑胺的療效

2、大部分是由于腦膠質(zhì)瘤細胞內(nèi) O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(O6-methylguanine DNA-methyltransferase，MGMT)的活性造成的,它是一種DNA修復酶主要能夠特定的移除O6-甲基鳥嘌呤上的甲基團從而逆轉(zhuǎn)替莫唑胺的療效。近期少數(shù)研究證據(jù)表明，在惡性膠質(zhì)瘤類干細胞，垂體腺瘤細胞和U251細胞中發(fā)現(xiàn)抑制缺氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor1α,HIF-1α)可以下調(diào)MGMT的

3、表達。HIF-1α在腫瘤血管生成、進展、復發(fā)和化療耐藥等方面扮演著重要的作用，其中也包括腦膠質(zhì)瘤。本實驗采用體外細胞培養(yǎng)技術(shù)，以人源性惡性膠質(zhì)瘤T98G細胞株為研究對象，觀察HIF-1α靶向抑制劑FM19G11是否影響替莫唑胺對惡性膠質(zhì)瘤T98G細胞株的細胞增殖抑制作用和誘導細胞凋亡作用，同時進一步探索它們之間的分子調(diào)控機制。
　　方法：
　　以人源性惡性膠質(zhì)瘤T98G細胞株為研究對象,T98G細胞培養(yǎng)于37℃恒溫缺氧培養(yǎng)箱

4、中，氣體條件為5%CO2,1%O2,94%N2。設(shè)置實驗對照組，使用不同濃度的HIF-1α靶向抑制劑FM19G11和替莫唑胺分別單獨處理以及二者的聯(lián)合處理T98G膠質(zhì)瘤細胞，采用CCK-8法和細胞克隆形成實驗分別檢測上述不同藥物處理后T98G細胞的細胞增殖抑制作用；采用hochest33258染色法和流式細胞技術(shù)分別測定在不同處理條件下T98G細胞的凋亡作用；采用qPCR法檢測在不同處理條件下T98G細胞內(nèi)HIF-1α及其下游靶基因的m

5、RNA表達量的差異；采用Western blot法檢測在不同處理條件下T98G細胞內(nèi)HIF-1α及其下游靶基因，以及MGMT和NF-κB信號通路中P65蛋白表達水平的差異；采用細胞免疫熒光技術(shù)檢測T98G細胞中MGMT和NF-κB信號通路中P65蛋白表達水平的差異。
　　結(jié)果：
　　⑴MGMT蛋白在各惡性膠質(zhì)瘤細胞株中呈差異性表達,篩選出MGMT高表達的細胞株。通過Western blot實驗結(jié)果表明，MGMT蛋白在惡性膠質(zhì)

6、瘤T98G細胞中呈陽性表達，而在U251，U87MG和U373細胞中MGMT表達均非常低或幾乎不表達。故選擇惡性膠質(zhì)瘤T98G細胞株作為接下來的實驗研究對象。⑵FM19G11和替莫唑胺各自單獨處理以及二者聯(lián)合處理惡性膠質(zhì)瘤T98G細胞后，通過CCK-8法和細胞克隆形成實驗分別檢測顯示FM19G11單獨處理對T98G細胞無增殖抑制作用，而替莫唑胺對T98G細胞的具有增殖抑制作用，但并不敏感；與替莫唑胺單獨處理相比，F(xiàn)M19G11和替莫唑胺

7、的聯(lián)合處理對惡性膠質(zhì)瘤T98G細胞具有顯著地增殖抑制作用（P＜0.05）。⑶通過顯微鏡下細胞形態(tài)學觀察與hoechst33258染色法觀察發(fā)現(xiàn)， FM19G11單獨處理并不誘導惡性膠質(zhì)瘤T98G細胞發(fā)生凋亡性形態(tài)改變，替莫唑胺單獨處理能夠使瘤細胞發(fā)生凋亡性形態(tài)改變，而二者的聯(lián)合作用對T98G細胞的凋亡形態(tài)改變的程度較替莫唑胺單獨處理更加明顯。⑷通過流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)M19G11單獨處理并不誘導T98G細胞發(fā)生凋亡，替莫唑胺單

8、獨處理能夠誘導T98G細胞發(fā)生凋亡作用，而二者的聯(lián)合處理對T98G細胞的凋亡誘導能力更強（P＜0.05）。⑸FM19G11作用后靶向抑制T98G細胞內(nèi)HIF-1α及其下游靶基因的表達水平。通過qPCR法和Western blot法結(jié)果顯示，在不同濃度的FM19G11處理下T98G細胞內(nèi)HIF-1α，VEGF和EPO的mRNA和蛋白表達均顯著低于正常對照組（P＜0.05),而且具有明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。⑹NF-κB信號通路可能參與FM19

9、G11抑制惡性膠質(zhì)瘤T98G細胞內(nèi)MGMT的表達水平。通過Western blot法實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在不同濃度FM19G11處理后MGMT和NF-κB P65蛋白表達均明顯低于正常對照組（P＜0.05）,而且具有明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。⑺通過細胞免疫熒光技術(shù)檢測惡性膠質(zhì)瘤T98G細胞內(nèi)MGMT和NF-κB P65的表達水平。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)在不同濃度FM19G11處理后瘤細胞內(nèi)MGMT和NF-κB P65蛋白的熒光強度顯著低于正常對照組（P＜0

10、.05）,而且具有明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。這進一步證明NF-κB信號通路可能參與FM19G11抑制惡性膠質(zhì)瘤T98G細胞內(nèi)MGMT的表達水平。⑻通過Western blot法檢測在FM19G11（2.0μM）和替莫唑胺（500μM）分別單獨處理及二者聯(lián)合處理后，實驗結(jié)果表明與正常對照組相比，F(xiàn)M19G11單獨處理能夠顯著下降T98G細胞內(nèi)MGMT蛋白的表達水平（P＜0.05），而替莫唑胺能夠上調(diào)T98G細胞內(nèi)MGMT蛋白的表達（P＜0.0

11、5）；而FM19G11和替莫唑胺的聯(lián)合處理能顯著降低瘤細胞內(nèi)MGMT蛋白的表達（P＜0.05）。最重要的是，我們觀察到FM19G11單獨處理不但能明顯下調(diào)NF-κB信號通路P65亞基的表達水平（P＜0.05），在它與替莫唑胺聯(lián)合作用之后，這種下調(diào)作用仍然十分顯著（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　FM19G11主要通過靶向抑制HIF-1α的表達，進而下調(diào)MGMT蛋白的表達，從而增加惡性膠質(zhì)瘤T98G細胞對替莫唑胺的藥物敏感性