mTOR信號(hào)通路調(diào)控膠質(zhì)瘤干細(xì)胞自我更新和替莫唑胺耐藥的分子機(jī)制研究.pdf

1、本研究圍繞膠質(zhì)瘤干細(xì)胞自我更新這一熱點(diǎn)領(lǐng)域，探討mTOR信號(hào)通路調(diào)控膠質(zhì)瘤干細(xì)胞自我更新和替莫唑胺耐藥相關(guān)分子機(jī)制。 第一部分膠質(zhì)瘤干細(xì)胞分離、體外培養(yǎng)、鑒定和異種腫瘤移植模型 目的：從人腦膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞株中分離腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞、進(jìn)行體外培養(yǎng)并鑒定其生物學(xué)特性，以及制作異種腫瘤移植模型。 方法：采用以CD133免疫磁珠分選技術(shù)從人腦膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞系SKMG—4中分離腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞并進(jìn)行體外無(wú)血清培養(yǎng)，通過(guò)免疫熒

2、光技術(shù)檢測(cè)分子標(biāo)志物CD133、Nestin、Sox—2以及譜系分化標(biāo)志物TuJ1和GFAP；建立裸鼠皮下和腦原位移植模型研究膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的致瘤性。 結(jié)果：經(jīng)CD133免疫磁珠分選的CD133+細(xì)胞群在膠質(zhì)瘤干細(xì)胞培養(yǎng)液中呈懸浮生長(zhǎng)，培養(yǎng)24～48小時(shí)，可見(jiàn)腫瘤球，能連續(xù)傳代并保持較好的增殖生長(zhǎng)能力；膠質(zhì)瘤干細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)的CD133-細(xì)胞群中大部分細(xì)胞呈貼壁生長(zhǎng)，未見(jiàn)明顯腫瘤球形成，一般無(wú)法繼續(xù)傳代培養(yǎng)或僅能傳1～2代。免疫熒

3、光染色結(jié)果表明，來(lái)源于0814、0816、0508和SKMG—4的腫瘤標(biāo)本經(jīng)CD133分選后培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞高表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記CD133、Nestin和Sox—2，分化譜系標(biāo)記GFAP和TuJ1表達(dá)較低，著色細(xì)胞含量均低于10％。CD133和Nestin免疫染色較強(qiáng)的細(xì)胞主要分布于腫瘤球表面。不同數(shù)量的CD133+膠質(zhì)瘤干細(xì)胞和CD133-膠質(zhì)瘤細(xì)胞注射于BALB/C裸小鼠背側(cè)皮下，膠質(zhì)瘤干細(xì)胞顱內(nèi)移植后4周，分離取得裸鼠腦組織后行

4、冰凍切片和H&E染色，移植瘤與親本腫瘤HE染色觀察比較，其病理表犁與親本腫瘤一致。 結(jié)論：人腦膠質(zhì)瘤組織和膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中存在的少量CD133+膠質(zhì)瘤細(xì)胞是膠質(zhì)瘤干細(xì)胞。 第二部分 mTOR信號(hào)通路調(diào)控膠質(zhì)瘤干細(xì)胞自我更新的分子機(jī)制研究 目的：研究mTOR信號(hào)通路調(diào)控膠質(zhì)瘤干細(xì)胞自我更新相關(guān)的分子機(jī)制 方法：Western blot檢測(cè)mTOR信號(hào)通路組分p—S6K、p—S6和干細(xì)胞自我更新相關(guān)基因Bmi-

5、1的表達(dá)水平；建立mTOR通路干預(yù)模型：激活模型和下調(diào)模型，腫瘤球形成試驗(yàn)評(píng)價(jià)干預(yù)mTOR信號(hào)通路對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞自我更新的影響；建立Bmi-1慢病毒shRNA干預(yù)模型，腫瘤球生成試驗(yàn)檢測(cè)Bmi-1基因沉默對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞自我更新的影響；免疫熒光檢測(cè)CD133/GFAP/TuJ1/Bmi-1/水平，評(píng)價(jià)干預(yù)mTOR通路和細(xì)胞分化的關(guān)系。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)分析軟件分析。 結(jié)果：Western blot蛋白電泳檢測(cè)結(jié)果表

6、明，和CD133-膠質(zhì)瘤細(xì)胞比較，CD133+膠質(zhì)瘤干細(xì)胞表達(dá)較高水平的mTOR信號(hào)通路組分p—S6K、p—S6和干細(xì)胞自我更新相關(guān)分子Bmi-1。免疫熒光檢測(cè)表明，CD133+膠質(zhì)瘤干細(xì)胞高表達(dá)p—S6K和Bmi-1，且p—S6高表達(dá)的細(xì)胞也具有較高的Bmi-1水平。mTOR信號(hào)通路激活模型和阻斷模型的研究結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)Rheb能夠激活mTOR信號(hào)通路，上調(diào)mTOR下游效應(yīng)器p—S6K和p—S6水平。通過(guò)rapamycin作用能夠特

7、異性阻斷mTOR通路，不減弱AKT和ERK1/2通路。腫瘤球形成試驗(yàn)表明，0814、0816、0508和SKMG—4的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞腫瘤球形成率Vector組為138.5±20.5、62.2±8.8、186.2±20.2和115.6±14.8，而Rheb組為180.2±20.8、85.1±9.5、250.5±24.8和149.3±16.5，組間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過(guò)rapamycin阻斷mTOR信號(hào)通路，0814、0816、0508和

8、SKMG—4的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞腫瘤球形成率對(duì)照組為135.2±15.5、62.3±8.2、182.3±20.6和108.6±12.5，rapamycin組為55.5±8.5、20.2±5.8、82.2±10.2和40.6±6.8，自噬抑制劑3-MA組為140.2±18.8、58.1±6.5、175.5±20.8和112.3±12.5，RPA+3-MA組為50.3±8.4、18.1±4.3、75.8±10.8和35.4±5.5。和對(duì)照組比較，

9、rapamycin處理顯著降低膠質(zhì)瘤干細(xì)胞腫瘤球形成能力，而3-MA處理不能逆轉(zhuǎn)rapamycin的效應(yīng)，表明rapamycin抑制膠質(zhì)瘤干細(xì)胞自我更新的效應(yīng)不依賴于自噬。 Western blot檢測(cè)表明，過(guò)表達(dá)Rheb和加入IGF-1激活mTOR信號(hào)通路能夠上調(diào)Bmi-1水平。通過(guò)rapamycin特異性阻斷mTOR通路能夠下調(diào)Bmi-1水平。Bmi-1基因沉默研究表明，shRNA介導(dǎo)的Bmi-1基因沉默顯著降低膠質(zhì)瘤干細(xì)

10、胞腫瘤球形成能力，而導(dǎo)入Rheb基因顯著增強(qiáng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞腫瘤球形成能力。通過(guò)shRNA下調(diào)Rheb過(guò)表達(dá)細(xì)胞中的Bmi-1水平可逆轉(zhuǎn)Rheb的促進(jìn)效應(yīng)，在導(dǎo)入Rheb的來(lái)源于SKMG—4、0814、0816和0508的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中，scramble組腫瘤球?yàn)?40.5±16.3、172.2±18.5、85.2±10.6和240.6±25.7，而Bmi-1 shRNA組為42.2±5.8、55.1±7.5、25.5±5.8和80.3±8

11、.5，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。免疫熒光染色結(jié)果表明，在來(lái)源于SKMG—4、0814、0816和0508的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中，經(jīng)rapamycin處理后，Bmi-1陽(yáng)性細(xì)胞率由對(duì)照組的90.2±5.2％、90.4±6.4％、80.3±4.2％和92.5±5.2％變?yōu)?5.3±3.4％、28.4±5.2％、10.2±2.4％和45.5±2.5％；TuJ1由對(duì)照組的2.1±1.2％、1.4±0.4％、6.3±3.5％和2.5±1.3％變?yōu)?8.5±

12、5.5％、18.4±6.4％、35.2±8.3％和8.5±3.6％；GFAP由對(duì)照組的5.2±1.5％、1.4±0.5％、9.3±4.5％和2.5±5.2％變?yōu)?5.4±4.2％、5.3±2.4％、45.6±6.2％和10.2±3.7％，組間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)論：mTOR信號(hào)通路能夠調(diào)控膠質(zhì)瘤干細(xì)胞自我更新，阻斷mTOR通路下調(diào)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞自我更新潛能，促進(jìn)其分化。mTOR信號(hào)通路對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞自我更新的調(diào)控作用可能由B

13、mi-1介導(dǎo)。 第三部分靶向mTOR信號(hào)通路逆轉(zhuǎn)替莫唑胺耐藥分子機(jī)制研究 目的：探討膠質(zhì)瘤干細(xì)胞對(duì)替莫唑胺耐受的分子機(jī)制，研究靶向mTOR信號(hào)通路逆轉(zhuǎn)替莫唑胺耐藥的分子機(jī)制。 方法： MTT法檢測(cè)藥物對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的殺傷作用。Western blot檢測(cè)藥物處理前后自噬相關(guān)分子Atg5、LC3B和Beclin-1水平；免疫熒光染色檢測(cè)藥物處理后CD133、GFAP、Atg5和active caspase—3水平。

14、電鏡觀察藥物處理后的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化。裸鼠腦原位移植腫瘤模型研究藥物處理對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的致瘤能力影響。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)分析軟件分析。 結(jié)果：免疫熒光技術(shù)檢測(cè)表明，MGMT在來(lái)源于SKMG—4的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中高表達(dá)，而在來(lái)源于0814、0816和0508的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中表達(dá)較低。細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)表明，經(jīng)臨床相關(guān)濃度替莫唑胺處理后，來(lái)源于SKMG—4、0814、0816和0508的CD133-細(xì)胞存活率兩者比較差異具有

15、顯著意義。另外，替莫唑胺對(duì)MGMT—膠質(zhì)瘤干細(xì)胞和MGMT+膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的殺傷率均低于5％。在來(lái)源于SKMG—4、0814、0816和0508的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中，藥物聯(lián)合組和藥物單用組比較差異均具有顯著意義。免疫熒光染色表明，替莫唑胺對(duì)CD133+膠質(zhì)瘤干細(xì)胞作用較弱，而聯(lián)合rapamycin則能顯著減少CD133+細(xì)胞比例。免疫熒光分析表明，替莫唑胺處理后，GFAP+細(xì)胞出現(xiàn)ATG5染色的自噬體，而CD133+細(xì)胞沒(méi)有變化，表明替莫唑胺

16、主要誘導(dǎo)CD133-細(xì)胞產(chǎn)生自噬。Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，替莫唑胺單藥處理膠質(zhì)瘤干細(xì)胞不能上調(diào)自噬相關(guān)分子Beclin-1、ATG5和LC3-Ⅱ的表達(dá)水平。替莫唑胺聯(lián)合rapamycin則能引起B(yǎng)eclin-1、ATG5和LC3-Ⅱ水平顯著升高。 裸鼠顱內(nèi)移植腫瘤研究表明，替莫唑胺預(yù)處理膠質(zhì)瘤干細(xì)胞不能降低其致瘤潛能，而rapamycin單用或聯(lián)合替莫唑胺能夠顯著降低膠質(zhì)瘤干細(xì)胞致瘤潛能。腦原位移植腫瘤切片H&E染

17、色表明，替莫唑胺對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞致瘤潛能影響不顯著，而替莫唑胺聯(lián)合rapamycin處理后的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞，移植4周后僅在某些移植鼠的大腦形成微小病灶。 結(jié)論：膠質(zhì)瘤干細(xì)胞較非膠質(zhì)瘤干細(xì)胞對(duì)替莫唑胺較為耐受，MGMT膠質(zhì)瘤干細(xì)胞也可能對(duì)替莫唑胺耐受。替莫唑胺主要作用于CD133膠質(zhì)瘤細(xì)胞，誘導(dǎo)其產(chǎn)生自噬。靶向mTOR信號(hào)通路能夠有效逆轉(zhuǎn)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞對(duì)替莫唑胺的耐藥，降低其致瘤潛能，產(chǎn)生自噬性細(xì)胞死亡。 研究小結(jié) 1、