YopJ的絲氨酸和賴(lài)氨酸雙乙?；钚约肮δ?pdf

1、本研究通過(guò)模擬耶氏鼠疫桿菌感染過(guò)程揭示細(xì)菌性乙酰轉(zhuǎn)移酶YopJ對(duì)絲氨酸乙?；c賴(lài)氨酸乙酰化的細(xì)胞學(xué)效應(yīng)。應(yīng)用鳥(niǎo)槍蛋白組學(xué)方法和label-free定量技術(shù)，我們比較了YopJ對(duì)細(xì)胞蛋白上的絲氨酸與賴(lài)氨酸殘基乙?；挠绊?。特別是我們鑒定出了膜相關(guān)泛素連接酶MARCH8上的絲氨酸與賴(lài)氨酸乙酰化位點(diǎn)并制備了針對(duì)MARCH8絲氨酸乙?；稽c(diǎn)的抗體，用免疫學(xué)方法證實(shí)了YopJ對(duì)March8絲氨酸和賴(lài)氨酸乙?；挠绊?。YopJ催化區(qū)突變體的研究表明

2、YopJ誘導(dǎo)的絲氨酸和賴(lài)氨酸乙?；谴呋瘏^(qū)依賴(lài)的，催化區(qū)突變體不能有效誘導(dǎo)絲氨酸和賴(lài)氨酸乙?；?。我們的結(jié)果表明絲氨酸乙?；竃opJ可以靶向其蛋白底物雙乙?；?lài)氨酸和絲氨酸殘基。
　　研究目的:
　　證實(shí)YopJ對(duì)絲氨酸和賴(lài)氨酸殘基雙乙酰化活性與功能
　　研究方法:
　　1、重組質(zhì)粒的構(gòu)建與在HeLa中的表達(dá):YopJ cDNA是全基因合成的，MARCH8 cDNA是通過(guò)RT-PCR方法從K562細(xì)胞中擴(kuò)增出來(lái)的

3、。MARCH8截?cái)囿w是1-156aa，全長(zhǎng)是1-291aa。cDNAs被亞克隆到pcDNA3.0-flag載體中，它們的序列都經(jīng)過(guò)測(cè)序驗(yàn)證。YopJ催化區(qū)突變體C172A是通過(guò)定點(diǎn)突變從YopJ重組質(zhì)粒中擴(kuò)增而來(lái)并經(jīng)過(guò)測(cè)序驗(yàn)證。重組質(zhì)粒經(jīng)過(guò)Omega大抽質(zhì)粒盒子純化后用Lipofectamine轉(zhuǎn)染到HeLa細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染24-48h后收集細(xì)胞提取蛋白。
　　2、蛋白提取:收集細(xì)胞用PBS洗三遍后，用Millipore RIPA裂解

4、液裂解，通過(guò)超聲或冰上裂解法獲取蛋白。
　　3、溶液內(nèi)酶解:在一個(gè)過(guò)濾膜(Microcon YM-30)上，加入50μg的蛋白樣品，200μ l含8M尿素的1M Tris-HCl中，離心，用50 mM的碳酸氫銨洗兩次，用含1μg胰酶的50 mM碳酸氫銨重懸，輕輕旋轉(zhuǎn)混勻，37℃酶解24h，用C18Ziptip脫鹽后，凍干貯存于-80℃?zhèn)溆谩?br>　　4、免疫沉淀和膠內(nèi)酶解:轉(zhuǎn)染MARCH8和（或）YopJ的HeLa細(xì)胞，常規(guī)方法

5、制得細(xì)胞抽提物，用Flag抗體免疫沉淀帶Flag標(biāo)簽的MARCH8，用SDS-PAGE膠分離，手術(shù)刀片切下MARCH8條帶，標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行膠內(nèi)酶解24h，過(guò)zip-tip脫鹽后，LC-MS/MS分析。
　　5、LC-MS/MS分析:取約2μg的肽段注射到C18柱中（200xφ0.075mm），用120 min的線性梯度（5-35％乙腈，0.1％的甲酸水）洗脫，然后用Orbitrap Elite質(zhì)譜儀檢測(cè)。數(shù)據(jù)的采集采用數(shù)據(jù)依賴(lài)模式，

6、所有掃描的一級(jí)質(zhì)譜中前20個(gè)最強(qiáng)的峰進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜測(cè)定。MS/MS二級(jí)質(zhì)譜用Mascot和Sequest搜索人蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)(UniProtKB，88295 entries)，分析軟件是Proteome Discoverer1.4(Thermo Scientific，San Jose，CA).MS/MS質(zhì)譜圖搜庫(kù)的容差是0.8 Da，10 ppm，動(dòng)態(tài)修飾是賴(lài)氨酸、絲氨酸乙?；?，甲硫氨酸氧化。所有修飾位點(diǎn)的確認(rèn)需要經(jīng)過(guò)人工檢索圖譜確定。

7、>　　6、Label-free定量:Label-free方法測(cè)量肽段的豐度是由Progenesis LC-MSsoftware(version4.1; Nonlinear Dynamics，UK)完成的。簡(jiǎn)言之，質(zhì)譜獲得的Raw文件用ReAdw-program程序轉(zhuǎn)換成mzxml格式，并輸入到ProgenesisLC-MS軟件中。多個(gè)分析并行時(shí)，離子強(qiáng)度圖可用來(lái)診斷檢測(cè)的缺陷。最好的數(shù)據(jù)集被選作數(shù)據(jù)校準(zhǔn)的參照。排除電荷數(shù)為1或＞4的肽段

8、。同時(shí)搜一個(gè)反庫(kù)(decoy database)來(lái)確定出錯(cuò)率(FDR)。每個(gè)通過(guò)質(zhì)譜確定的有效肽段的定量定義為該位點(diǎn)的所有肽段豐度之和。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析根據(jù)某一位點(diǎn)所有乙?；亩呜S度之和與未修飾肽段之和的比值。溶液內(nèi)酶解的數(shù)據(jù)，有時(shí)找不到對(duì)應(yīng)的非乙酰化肽段，就采用某一位點(diǎn)所有乙?；亩呜S度之和與一套α-actin的參考肽段豐度之和的比值.
　　7、MARCH8 Sac71多克隆抗體的制備:化學(xué)合成March8乙?；亩蜸ac71，Ac-

9、T(Sac) ITPSSQDICRICHCEGDC-NH2及相應(yīng)的未修飾肽段 S71，Ac-TSITPSSQDICRICHCEGDC-NH2，并經(jīng)質(zhì)譜驗(yàn)證純度在90％以上。乙?；亩闻cBSA偶聯(lián)后，免疫新西蘭大白兔三次，末次免疫10天后采血用ELISA法測(cè)抗體滴度，末次注射15天后采取所有的血樣收集抗血清。抗血清過(guò)兩次與未修飾肽段偶聯(lián)的色譜柱去除與未修飾肽段結(jié)合部分，再過(guò)一次與修飾肽段偶聯(lián)的色譜柱,收集與修飾肽段結(jié)合的成分?？贵w的特異性

10、經(jīng)過(guò)Dot-blot和競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。
　　8、免疫沉淀-WB:帶Flag標(biāo)簽的MARCH8用Flag抗體進(jìn)行免疫沉淀，沉淀得到的蛋白用SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用5％ BSA封閉。一抗用anti-flag、泛賴(lài)氨酸乙酰化抗體、MARCH8 Sac71抗體檢測(cè)。二抗是熒光標(biāo)記的IRDye800CW或IRDye680CW conjugated IgG，結(jié)果用LI-COR遠(yuǎn)紅外成像系統(tǒng)掃描。
　　9、體外乙酰

11、化實(shí)驗(yàn)（用YopJ重組細(xì)胞抽提物）:轉(zhuǎn)染有MARCH8的HeLa細(xì)胞抽提物用Flag抗體進(jìn)行IP，將MARCH8固定在瓊脂糖珠子上，進(jìn)行體外乙?；磻?yīng)。第一份與空載對(duì)照pcDNA3.0-flag的細(xì)胞抽提物孵育，第二份與轉(zhuǎn)染YopJ的HeLa細(xì)胞抽提物孵育，第三份與轉(zhuǎn)染YopJ突變體C172A的HeLa細(xì)胞抽提物孵育。所有體系中都添加乙酰輔酶A，蛋白酶抑制劑，去乙?；敢种苿?7℃孵育1h，孵育結(jié)束后，洗滌，用western-blo

12、t分析結(jié)果。一抗為anti-flag、泛賴(lài)氨酸乙?；贵w(Pan-K)、MARCH8 Sac71抗體。
　　研究結(jié)果:
　　1、乙酰轉(zhuǎn)移酶YopJ介導(dǎo)了HeLa細(xì)胞蛋白絲氨酸和賴(lài)氨酸殘基的雙乙?；?用鳥(niǎo)槍蛋白組學(xué)和Label-free定量，我們證明YopJ的轉(zhuǎn)染可以引起細(xì)胞蛋白絲氨酸和賴(lài)氨酸乙?；奶岣撸渲邪?0個(gè)絲氨酸乙?；稽c(diǎn)(YopJ/non-YopJ1.3-fold，p=0.02)和8個(gè)賴(lài)氨酸乙酰化位點(diǎn)(YopJ

13、/non-YopJ3.5-fold，p=0.00003)。
　　2、絲氨酸乙?；竃opJ可以雙乙?；疎3泛素連接酶MARCH8的絲氨酸和賴(lài)氨酸殘基:用免疫沉淀和LC-MS/MS證明，YopJ的轉(zhuǎn)染可以雙乙?；疢ARCH8的S44，S71，S253位點(diǎn)以及K247，K252位點(diǎn)。label-free定量表明YopJ轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞中Sac253和Sac44分別提高了28±11(p=0.002)和31±8(p=0.002)倍，Ka

14、c252和Kac247分別提高了36±18(p=0.0003)和18±8(p=0.01)倍。
　　3、體內(nèi)外免疫實(shí)驗(yàn)均證明乙酰化酶YopJ可以雙乙?；疢ARCH8的絲氨酸和賴(lài)氨酸殘基:為證實(shí)YopJ對(duì)MARCH8的雙乙?；饔茫覀冎苽淞薓ARCH8 Sac71特異性抗體，Dot-blot和競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)均證明該抗體是針對(duì)Sac71的特異性抗體。IP-WB證實(shí)YopJ與MARCH8共轉(zhuǎn)HeLa細(xì)胞之后，MARCH8的絲氨酸和賴(lài)氨酸乙?；?/p>

15、水平都得到明顯提高，絲氨酸乙酰化提高了1.8倍(1.8±0.5，p=0.027，n=3)，賴(lài)氨酸乙?；岣吡?.9倍(1.9±0.4，p=0.012，n=3)，證明MARCH8中可以在體內(nèi)提高絲氨酸和賴(lài)氨酸乙?；?。與此一致的是，共轉(zhuǎn)YopJ的催化區(qū)突變體C172A與MARCH8，MARCH8的絲氨酸和賴(lài)氨酸乙?；讲⑽吹玫较鄳?yīng)的提高，說(shuō)明YopJ的雙乙酰化作用是催化區(qū)依賴(lài)的。為進(jìn)一步證明YopJ是直接乙酰化了MARCH8的賴(lài)氨酸和

16、絲氨酸殘基，我們又進(jìn)行了體外試驗(yàn)，首先我們用免疫沉淀得到的MARCH8與轉(zhuǎn)染YopJ的HeLa細(xì)胞抽提物及乙酰輔酶A于37℃共同孵育1h，然后用MARCH8 Sac71和Pan-K乙?；贵w分別檢測(cè)MARCH8的絲氨酸和賴(lài)氨酸乙?；?，結(jié)果與空載對(duì)照相比，YopJ可以明顯提高M(jìn)ARCH8的絲氨酸和賴(lài)氨酸乙?；蕉渫蛔凅wC172A的這種能力明顯降低。為進(jìn)一步排除YopJ細(xì)胞抽提物中其他因素的干擾，我們又用純化的YopJ進(jìn)行了體外乙酰

17、化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果與用YopJ細(xì)胞抽提物得到的結(jié)果相似，充分證明了YopJ對(duì)MARCH8絲氨酸和賴(lài)氨酸殘基的雙乙?；饔?。
　　4、YopJ對(duì)MARCH8的雙乙?；岣吡薓ARCH8的自身泛素化水平且這種作用是催化區(qū)依賴(lài)的:為探討YopJ對(duì)MARCH8的雙乙?；募?xì)胞學(xué)或生物學(xué)功能，我們檢測(cè)了MARCH8的自身泛素化水平。結(jié)果表明，與YopJ共轉(zhuǎn)的MARCH8的體外自身泛素化水平比單轉(zhuǎn)MARCH8的明顯提高，YopJ突變體C172A提高

18、MARCH8自身泛素化水平的能力明顯降低，說(shuō)明這一能力是催化區(qū)依賴(lài)的。
　　研究結(jié)論:
　　我們通過(guò)鳥(niǎo)槍蛋白組學(xué)和Label-free方法證明了絲氨酸乙?；竃opJ對(duì)細(xì)胞蛋白水平和靶蛋白MARCH8絲氨酸和賴(lài)氨酸殘基的雙乙酰化，并用免疫學(xué)方法用體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明了YopJ對(duì)MARCH8的雙乙?；?，提示絲氨酸乙?；唾?lài)氨酸乙酰化之間可能構(gòu)成網(wǎng)絡(luò)。特別是，YopJ的雙乙?；瘏⑴c了MARCH8的自身泛素化過(guò)程，提示了MARCH8雙乙