雪里蕻滯綠基因SGR的克隆及轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、綠色植物的葉片由于含有豐富的葉綠素而呈現(xiàn)綠色，植物物種間或者同一物種的不同時(shí)期可以呈現(xiàn)出不同的顏色也是由于不同的色素所造成的。其色素組成受遺傳和環(huán)境刺激的影響，是其合成與降解之間相互平衡的結(jié)果。近年來(lái)，葉綠素的合成途徑已經(jīng)研究的比較清楚，而對(duì)于其降解途徑，隨著水稻中sgr(t)滯綠突變體的發(fā)現(xiàn)及SGR基因的識(shí)別，研究者對(duì)于葉綠素降解的起始階段又有了新的認(rèn)識(shí)。目前，SGR基因已經(jīng)在很多物種中被發(fā)現(xiàn)，它的功能缺失可以導(dǎo)致綠色植物出現(xiàn)滯綠突變

2、，但是其機(jī)制目前還不清楚。通過(guò)對(duì)更多的SGR基因及其滯綠突變體進(jìn)行研究，對(duì)于探明SGR基因的作用機(jī)制及葉綠素降解途徑將有所幫助。
　　本課題中，我們分析了已報(bào)道的各物種SGR滯綠基因的同源性，并設(shè)計(jì)特異引物，分別克隆了雪里蕻和白菜的SGR基因的編碼區(qū)。對(duì)獲得的基因序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，并對(duì)雪里蕻SGR基因的表達(dá)模式進(jìn)行了分析。為了進(jìn)一步研究雪里蕻和白菜SGR基因的功能，本研究構(gòu)建了雪里蕻和白菜SGR基因的RNAi沉默載體，并采

3、用了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序浸染法和組織培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法，進(jìn)行了雪里蕻的遺傳轉(zhuǎn)化。本研究的主要結(jié)果如下：
　　①成功的克隆了雪里蕻和白菜的SGR基因的編碼區(qū)，測(cè)序結(jié)果表明，雪里蕻和白菜的SGR基因序列都是807bp，它們幾乎完全相同，只有三個(gè)堿基的差別。雪里蕻SGR基因與擬南芥NYE1的同源性為85％、烏塌菜91%、煙草77%、番茄76%等。
　?、谕ㄟ^(guò)生物信息學(xué)分析表明，雪里蕻和白菜的SGR基因都編碼了268個(gè)氨基酸殘基，并且序列完全相

4、同，分子量為30.3kD，等電點(diǎn)為8.56。同時(shí)雪里蕻SGR基因編碼的蛋白是一個(gè)具有N末端葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽與信號(hào)肽的非分泌蛋白。在細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)中可能定位于葉綠體中，分布于葉綠體基質(zhì)、淀粉體。由于其不具跨膜結(jié)構(gòu)，而又具有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，因此可能是在細(xì)胞中直接參與信號(hào)的傳導(dǎo)或者反應(yīng)。其編碼的氨基酸序列和其它SGR蛋白有很高的同源性，并且和其它SGR蛋白一樣都含有一個(gè)高度保守的C末端基序(C-X3-C-X-C2-F-P-X5-P)，與擬南芥NYE1

5、蛋白的同源性為87%、水稻61%。和蕓薹屬中烏塌菜的SGR蛋白的同源性為92%，除了中間插入的21個(gè)氨基酸外，只有一個(gè)氨基酸的差別。通過(guò)和其它物種的氨基酸序列對(duì)比發(fā)現(xiàn)，對(duì)于烏塌菜多出的21個(gè)氨基酸序列，除了結(jié)縷草的整個(gè)氨基酸序列較短外，其它物種中都不具有這個(gè)序列。這進(jìn)一步說(shuō)明這個(gè)序列很可能是后期插入的，而烏塌菜的SGR基因也可能因此造成功能缺失。
　　③雪里蕻SGR基因（Brassicajunceavar.crispifolia，

6、BjSGR）表達(dá)模式分析表明，BjSGR基因受衰老誘導(dǎo)而特異地表達(dá)。在幼嫩葉中表達(dá)量很低，而在綠色稍微褪去的衰老葉片中其表達(dá)量迅速增加。
　　④通過(guò)對(duì)擬南芥花序浸染法的探索和改進(jìn)，采取用移液槍點(diǎn)滴重懸液的方式轉(zhuǎn)化雪里蕻(雪里蕻，Brassicajunceavar.crispifolia)花蕾，最終獲得了轉(zhuǎn)基因雪里蕻。同時(shí)通過(guò)對(duì)影響轉(zhuǎn)化效率的蔗糖濃度、表面活性劑濃度、菌液OD600值等進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)用5%的蔗糖(w/v)+0.03%

7、的Silwet-77(v/v)重懸農(nóng)桿菌，使重懸液的菌液濃度OD600為0.8時(shí)，可以獲得較高的轉(zhuǎn)化效率，轉(zhuǎn)化率為2.3%。該方法避免了真空操作及浸染時(shí)間的影響，使得操作更加簡(jiǎn)便，且轉(zhuǎn)化周期更短，為雪里蕻的遺傳轉(zhuǎn)化提供了一種更為簡(jiǎn)便的轉(zhuǎn)化方法。
　?、菰诮M織培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法中，通過(guò)對(duì)外植體的選擇以及激素配比研究發(fā)現(xiàn)，2mg/L6-BA+0.2mg/LNAA組的子葉的芽再生率較高，并且獲得了抗性苗，目前處于誘導(dǎo)生根階段。這為以后研究雪里蕻