TNFAIP8與LATS1相互作用抑制Hippo通路而促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖與侵襲.pdf

1、目的:肺癌作為世界上導(dǎo)致死亡的主要惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著人類的健康，近年來，隨著工業(yè)的發(fā)展和大氣環(huán)境的污染導(dǎo)致肺癌的發(fā)病率和死亡率有所上升。由于早期肺癌癥狀的不典型性和隱蔽性，往往導(dǎo)致患者在發(fā)現(xiàn)肺癌時錯過了最佳治療時機(jī)。而在腫瘤發(fā)生發(fā)展的早期，一些腫瘤相關(guān)分子已經(jīng)發(fā)生變化，因此能否發(fā)現(xiàn)肺癌的特異性分子及其相關(guān)的作用機(jī)制對于肺癌的早期診斷以及爭奪治療時機(jī)和治療方面都有著重要的意義。TNFAIP8作為一個致癌基因首先發(fā)現(xiàn)在人頭頸部鱗狀細(xì)胞

2、癌的細(xì)胞系中，其含有一個死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域(DED)，與FHP蛋白相似，能夠競爭性抑制caspase8與誘導(dǎo)死亡信號復(fù)合物(DISC)結(jié)合從而抑制細(xì)胞的凋亡，參與腫瘤的形成。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)TNFAIP8在前列腺癌，食道癌，卵巢癌，子宮內(nèi)膜癌，結(jié)直腸癌等許多人類腫瘤中發(fā)揮作用，我們也曾報道過，TNFAIP8在肺癌中過表達(dá)并且具有促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖和侵襲的作用，然而TNFAIP8的作用機(jī)制尚不十分清楚。Hippo通路是近年來發(fā)現(xiàn)的一條影響組織生長與發(fā)育

3、的通路，后來發(fā)現(xiàn)該通路在許多實體腫瘤中存在著失調(diào)，已有報道Hippo通路的異常與肺癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。盡管近年來研究者們對于Hippo通路的作用機(jī)制進(jìn)行了深入的研究，然而有關(guān)調(diào)控該通路的相關(guān)分子和作用機(jī)制還遠(yuǎn)沒有被揭示。我們在實驗中發(fā)現(xiàn)改變TNFAIP8的表達(dá)可以影響Hippo通路的靶基因CTGF的表達(dá)水平，這提示了TNFAIP8的作用發(fā)揮可能與Hippo通路有關(guān)。因此，本研究的目的就是探索TNFAIP8促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖與侵襲的相關(guān)

4、機(jī)制，同時揭示TNFAIP8調(diào)節(jié)Hippo通路的潛在分子機(jī)制。
　　研究方法:采用蛋白免疫印跡(Western Blot)的方法對TNFAIP8蛋白以及Hippo通路的關(guān)鍵分子YAP及其靶基因CTGF和上游核心激酶成分LATS1，MST1/2和MOB1以及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)蛋白E-CA，N-CA，Vimentin，細(xì)胞周期相關(guān)蛋白cyclinD、CDK4、CDK6、P27，侵襲相關(guān)蛋白MMP7等進(jìn)行相關(guān)蛋白定量的測定;采

5、用轉(zhuǎn)染和干擾技術(shù)以改變細(xì)胞系中TNFAIP8、YAP和LATS1的蛋白表達(dá)，并采用Westem Blot方法進(jìn)行效率的驗證;采用qRT-PCR的方法檢測CTGF的mRNA水平;核漿分離實驗和免疫熒光實驗檢測TNFAIP8蛋白對YAP蛋白核定位的變化以及TNFAIP8蛋白與LATS1蛋白的共定位情況;免疫共沉淀實驗檢測了TNFAIP8蛋白與LATS1蛋白之間的相互作用;采用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測TNFAIP8對Hippo通路活性影

6、響的變化;集落形成實驗和基質(zhì)膠侵襲實驗分別檢測細(xì)胞增殖能力和侵襲能力的變化;采用SPSS16.0統(tǒng)計分析軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:1.TNFAIP8抑制Hippo通路的活性。我們首先檢測了TNFAIP8蛋白在正常支氣管上皮細(xì)胞(HBE)及4種肺癌細(xì)胞系(H1299 H446，A549，H460)中的基礎(chǔ)表達(dá)，并選取了相對低表達(dá)TNFAIP8的H460細(xì)胞系轉(zhuǎn)染了TNFAIP8表達(dá)質(zhì)粒

7、，而在高表達(dá)TNFAIP8的H1299細(xì)胞中采用SiRNA干擾其內(nèi)源性TNFAIP8的表達(dá)。熒光素酶報告基因顯示在H460細(xì)胞中轉(zhuǎn)染TNFAIP8的表達(dá)質(zhì)粒能夠顯著增加TEAD的轉(zhuǎn)錄活性，上調(diào)Hippo通路中關(guān)鍵分子YAP的負(fù)向靶基因CTGF的蛋白水平和mRNA水平（Hippo通路活性被抑制），而在H1299細(xì)胞中干擾TNFAIP8的表達(dá)后，Hippo通路活性呈現(xiàn)相反的改變（增加），CTGF的蛋白和mRNA表達(dá)水平均下調(diào)，提示TNFAI

8、P8參與著Hippo通路活性的調(diào)節(jié)。2.TNFAIP8抑制Hippo通路的活性依賴于YAP及其入核。為了探索TNFAIP8影響Hippo通路活性的可能機(jī)制，我們在H460細(xì)胞中轉(zhuǎn)染TNFAIP8質(zhì)粒后，發(fā)現(xiàn)YAP的蛋白總量增加而磷酸化水平下降，核漿分離實驗和免疫熒光實驗均顯示YAP在細(xì)胞核中的分布增加，而在H1299細(xì)胞中干擾TNFAIP8蛋白表達(dá)后，上述結(jié)果卻相反。此外，在干擾掉內(nèi)源性YAP的表達(dá)后，TNFAIP8對cyclinD1，

9、CDK6，P27，MMP7及CTGF的影響均消失，對Hippo通路活性的影響也消失，上述結(jié)果表明TNFAIP8發(fā)揮抑制Hippo通路活性的作用依賴于YAP的存在和入核。3.LATS1是TNFAIP8抑制Hippo通路活性的靶分子。為了進(jìn)一步探究TNFAIP8調(diào)節(jié)YAP的分子機(jī)制，我們檢測了Hippo通路中上游核心激酶LATS1，MST1/2和MOB1蛋白磷酸化水平的變化，Western Blot結(jié)果顯示在H460細(xì)胞中過表達(dá)TNFAIP

10、8后，能夠下調(diào)LATS1的磷酸化水平，然而在H1299細(xì)胞中干擾TNFAIP8后，LATS1的磷酸化水平增加，而LATS1的蛋白總量及MST1/2、MOB1的磷酸化水平均沒有發(fā)生明顯的變化。此外，在干擾LATS1的基礎(chǔ)上，轉(zhuǎn)染或干擾TNFAIP8，其對細(xì)胞周期相關(guān)蛋白、MMP7及YAP和CTGF的影響均被減弱。免疫熒光實驗顯示TNFAIP8與LATS1存在著共定位，免疫共沉淀技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn):TNFAIP8與LATS1能夠相互作用。上述結(jié)果

11、表明，TNFAIP8是通過與LATS1相互作用，下調(diào)LATS1的磷酸化水平，進(jìn)而對YAP的磷酸化水平、蛋白水平及其入核進(jìn)行調(diào)節(jié)，提示LATS1是TNFAIP8參與調(diào)節(jié)Hippo通路活性的作用靶點。4.中斷Hippo通路能夠解除TNFAIP8促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖與侵襲。為了證實TNFAIP8促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖和侵襲是通過Hippo通路來實現(xiàn)的，我們在H460細(xì)胞中分別干擾Hippo通路的核心激酶LATS1和關(guān)鍵分子YAP的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TN