Phb1與CLIC1相互作用的初步研究.pdf

1、目的：酵母雙雜交技術證實phb1與CLIC1在酵母中的相互作用；構建帶FLAG標簽的phb1真核表達載體和帶GFP標簽的CLIC1真核表達載體；將其共轉染至COS7細胞，觀察其在哺乳細胞株內的共定位的具體情況；轉染至HEK293T細胞，進行免疫共沉淀，檢測在哺乳動物細胞內phb1蛋白與CLIC1蛋白能否相互結合。
　　 方法：以含人phb1全長cDNA序列的質粒pLenti6-phb1為模板，用PCR方法擴增phb1全長序列，雙

2、酶切后回收目的片段，連接到載體pGADT7上，構建酵母表達載體pGADT7-phb1；雙酶切pGADT7-phb1 回收目的片段，連接到載體pGBKT7上，構建載體pGBKT7-phb1；以pACT2-CLIC1為模板，用PCR方法擴增CLIC1全長序列，BamHⅠ單酶切回收目的片段，連接到pGBKT7上，構建酵母表達載體pGBKT7-CLIC1和pGADT7-CLIC1。把測序正確的酵母表達載體分組轉化至酵母菌AH109，在SD/-L

3、eu/-Trp/-His/＋3-AT/X-α-gal盤上篩選藍色的克隆。呈藍色的克隆是α-gal活性為陽性的克隆，再通過濾膜印跡實驗測定b-半乳糖苷酶活性進一步驗證它們的相互作用情況。用PCR方法擴增phb1全長序列構建真核表達質粒pCDNA3-FLAG-phb1，后轉染至COS7細胞，在熒光顯微鏡下觀察其在細胞的定位；將構建正確的質粒pCDNA3-FLAG-phb1和pCDGFP-CLIC1共同轉染至COS7細胞，通過免疫熒光顯微鏡觀

4、察phb1蛋白和CLIC1蛋白在細胞內的共定位情況；將質粒pCDNA3-FLAG-phb1和pCDGFP-CLIC1共同轉染至HEK293T細胞，提取細胞裂解液，進行免疫共沉淀，后通過Western blot檢測在哺乳動物細胞內phb1蛋白與CLIC1蛋白能否結合。
　　 結果：經(jīng)酶切和測序鑒定，各組質粒均構建正確。營養(yǎng)篩選及α，b-半乳糖苷酶活性的測定均表明phb1和CLIC1能相互作用；pCDNA3-FLAG-phb1和pC

5、DGFP-CLIC1轉染至COS7細胞中，免疫熒光顯微鏡觀察phb1和CLIC1共定位于細胞核周圍區(qū)域；免疫共沉淀和Western blot檢測證明phb1蛋白和CLIC1蛋白在HEK293T細胞中相互結合。
　　 結論：酵母雙雜交系統(tǒng)3初步證實phb1和CLIC1之間存在相互作用；免疫熒光顯微鏡觀察pCDNA3-FLAG-phb1和pCDGFP-CLIC1在COS7細胞中存在共定位，主要聚集于胞質中；免疫共沉淀和Western