miR-181a通過(guò)激活mTOR信號(hào)通路參與學(xué)習(xí)記憶的形成.pdf

1、學(xué)習(xí)記憶的鞏固過(guò)程是將獲取的短時(shí)記憶轉(zhuǎn)變?yōu)殚L(zhǎng)時(shí)記憶的漸變過(guò)程。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，基因和蛋白信號(hào)通路的激活表達(dá)等過(guò)程都參與了記憶的鞏固過(guò)程。記憶獲得后的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)和蛋白合成對(duì)記憶的鞏固過(guò)程起到十分重要的作用。然而，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的miRNA有成千上萬(wàn)種之多，這么多的miRNA是否都在學(xué)習(xí)記憶過(guò)程中發(fā)揮作用？不同的miRNA在學(xué)習(xí)記憶中發(fā)揮相同還是不同的作用？哪些miRNA參與海馬腦區(qū)的學(xué)習(xí)記憶過(guò)程？這一問(wèn)題目前尚不清楚。
　　目的:

2、
　　探究在CFC(場(chǎng)景性恐懼記憶)記憶鞏固過(guò)程中發(fā)生內(nèi)在表達(dá)變化miRNA;通過(guò)特異性阻斷或過(guò)表達(dá)這些miRNA，在動(dòng)物整體水平探究缺失或過(guò)表達(dá)特異的miRNA后對(duì)學(xué)習(xí)記憶鞏固過(guò)程的影響，明確這些miRNA在學(xué)習(xí)記憶過(guò)程中的功能，并探究其分子調(diào)控機(jī)制，確定其參與學(xué)習(xí)記憶鞏固過(guò)程所調(diào)控的靶基因或信號(hào)通路，為今后以特異性miRNA為靶點(diǎn)改善神經(jīng)退行性疾病所造成的記憶缺陷提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　1. 探究在CFC訓(xùn)

3、練后海馬腦區(qū)發(fā)生表達(dá)變化的miRNA
　　1.1 通過(guò)基因芯片分析CFC訓(xùn)練后海馬腦區(qū)發(fā)生變化的miRNA
　　取8周大小的C57/BL6雄性小鼠，進(jìn)行CFC訓(xùn)練，在CFC訓(xùn)練后1小時(shí)取海馬腦區(qū)，以單獨(dú)給予足底電擊刺激后1小時(shí)的海馬腦區(qū)為其對(duì)照，在杭州聯(lián)川生物有限公司進(jìn)行基因芯片分析，對(duì)芯片結(jié)果中信號(hào)強(qiáng)度大于500的miRNA進(jìn)行分析，找到在CFC訓(xùn)練后發(fā)生顯著變化的miRNA。
　　1.2 RT-PCR驗(yàn)證上述被篩選

4、出來(lái)的miRNA在CFC訓(xùn)練后1小時(shí)的變化
　　我們將上述基因芯片篩選出來(lái)的所有miRNA進(jìn)行RT-PCR的驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)在CFC訓(xùn)練1小時(shí)之后miR-181a，miR-126，miR-222，miR-143，miR-151a等miRNA水平上調(diào)，而miR-125，miR-690二者的水平下調(diào)。
　　1.3 海馬腦區(qū)特異性阻斷上述miRNA后檢測(cè)其對(duì)小鼠CFC學(xué)習(xí)記憶的影響
　　我們采用不同的antagomirs來(lái)特異性阻

5、斷相應(yīng)的miRNA。我們?cè)诮o小鼠海馬腦區(qū)分別注射miR-143和miR-181a的antagomirs之后，進(jìn)行CFC訓(xùn)練及測(cè)試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)海馬腦區(qū)miR-143被阻斷后對(duì)場(chǎng)景性恐懼記憶的獲得和鞏固過(guò)程均無(wú)影響;而阻斷miR-181a后小鼠場(chǎng)景性恐懼記憶的獲得并未受到影響，而鞏固過(guò)程則受到明顯損傷，這個(gè)實(shí)驗(yàn)說(shuō)明miR-181a參與小鼠CFC的鞏固過(guò)程，而miR-143則可能不參與。接下來(lái)，為了驗(yàn)證其他有變化的miRNA在海馬依賴性學(xué)習(xí)記憶

6、中的功能，我們會(huì)繼續(xù)將不同miRNA的antagomirs注射進(jìn)小鼠海馬腦區(qū)，進(jìn)行CFC訓(xùn)練和測(cè)試，觀察其是否對(duì)小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能產(chǎn)生影響。
　　1.4 海馬腦區(qū)特異性過(guò)表達(dá)上述miRNA后對(duì)CFC學(xué)習(xí)記憶的影響
　　我們將采用慢病毒注射的方式在海馬腦區(qū)來(lái)特異性過(guò)表達(dá)不同的miRNA，在注射過(guò)表達(dá)慢病毒四周后進(jìn)行CFC訓(xùn)練和測(cè)試，觀察過(guò)表達(dá)miR-181a或其他miRNA能否對(duì)小鼠場(chǎng)景性恐懼記憶產(chǎn)生影響。
　　2. 探

7、究miR-181a及其他miRNA參與CFC記憶鞏固過(guò)程的調(diào)控機(jī)制
　　2.1 Luciferase reporter assay驗(yàn)證miR-181a對(duì)PRKAA1和REDD1的調(diào)控
　　通過(guò)前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-181a參與海馬腦區(qū)CFC記憶的鞏固過(guò)程。miRNA在細(xì)胞中通常是作為一種轉(zhuǎn)錄抑制因子而存在，那么miR-181a究竟是通過(guò)調(diào)控何種靶基因來(lái)參與海馬腦區(qū)CFC記憶的鞏固過(guò)程的呢？我們首先通過(guò)不同的軟件（Target

8、scan，miR-22，miRDB，microcosm）預(yù)測(cè)在細(xì)胞中可能受到miR-181a調(diào)控的靶基因，然后將每個(gè)軟件預(yù)測(cè)出的結(jié)果通過(guò)KEGG分析這些受miR-181a調(diào)控的靶基因所在的信號(hào)通路，最后將這四個(gè)軟件的KEGG分析結(jié)果取交集，縮小篩選范圍。通過(guò)這種方法，我們發(fā)現(xiàn)mTOR信號(hào)通路中的PRKAA1和REDD1這兩個(gè)蛋白可能是受到miR-181a調(diào)控的靶基因。為了驗(yàn)證我們的預(yù)測(cè)是否準(zhǔn)確，我們將這幾個(gè)基因與miR-181a結(jié)合的3

9、'UTR區(qū)域連接到特殊的質(zhì)粒上，并將其種子序列進(jìn)行了突變處理作為對(duì)照，然后分組進(jìn)行Luciferase reporter assay實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證PRKAA1和REDD1在細(xì)胞中是否受到miR-181a的直接調(diào)控。
　　2.2 CFC訓(xùn)練后miR-181a對(duì)PRKAA1和REDD1蛋白變化的調(diào)控
　　我們擬在CFC訓(xùn)練之后0小時(shí)，1小時(shí)，2小時(shí)，4小時(shí)，8小時(shí)分別取材，檢測(cè)這兩個(gè)蛋白的表達(dá)水平。接下來(lái)，我們想通過(guò)在小鼠海馬腦區(qū)注

10、射antagomirs來(lái)特異性阻斷海馬腦區(qū)的miR-181a，然后再給予小鼠CFC訓(xùn)練刺激，最后取出小鼠海馬腦區(qū)檢測(cè)在阻斷miR-181a后，CFC訓(xùn)練刺激能否依然降低PRKAA1和REDD1的蛋白水平。通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)，我們將判斷在CFC記憶過(guò)程中，miR-181a能否調(diào)控PRKAA1和REDD1這兩個(gè)靶蛋白。
　　2.3 miR-181a參與CFC記憶的鞏固過(guò)程依賴其靶基因PRKAA1和REDD1
　　為了更深入的研究miR

11、-181a能否調(diào)控靶基因PRKAA1和REDD1參與海馬CFC記憶的鞏固過(guò)程，我們將在行為學(xué)層次探究miR-181a參與海馬CFC記憶的鞏固是否依賴于PRKAA1和REDD1這兩個(gè)靶基因。
　　3. 探究miR-181a對(duì)mTOR信號(hào)通路的調(diào)控
　　我們首先擬在CFC之后不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)mTOR蛋白的活性變化。接下來(lái)我們首先要探究海馬腦區(qū)miR-181a在CFC訓(xùn)練后能否調(diào)控mTOR蛋白的活性。我們?cè)谛∈蠛ｑR腦區(qū)注射miR-1

12、81a的antagomirs來(lái)阻斷miR-181a，然后對(duì)這些小鼠進(jìn)行CFC訓(xùn)練，訓(xùn)練結(jié)束后4小時(shí)取出小鼠海馬腦區(qū)，檢測(cè)mTOR蛋白活性的變化，觀察阻斷miR-181a之后能否阻斷CFC訓(xùn)練引起的mTOR蛋白活性升高，以此來(lái)觀察在CFC記憶鞏固過(guò)程中miR-181a能否調(diào)控mTOR蛋白的活性變化。
　　結(jié)果:
　　1. CFC訓(xùn)練之后1小時(shí)海馬腦區(qū)miR-181a的表達(dá)升高
　　我們?cè)贑FC訓(xùn)練后1小時(shí)和6小時(shí)取小鼠海

13、馬腦區(qū)，通過(guò)RT-PCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，在CFC訓(xùn)練后1小時(shí)，miR-181a表達(dá)顯著升高，而單獨(dú)給予環(huán)境暴露或足底電擊刺激并不能提高miR-181a的表達(dá)水平。
　　2. miR-181a參與調(diào)控小鼠CFC記憶的鞏固過(guò)程
　　我們將小鼠海馬腦區(qū)miR-181a阻斷后，進(jìn)行CFC訓(xùn)練和測(cè)試后發(fā)現(xiàn)，阻斷小鼠海馬腦區(qū)miR-181a并不影響小鼠CFC訓(xùn)練和短時(shí)記憶，但損傷了小鼠CFC的長(zhǎng)時(shí)記憶。相反，過(guò)表達(dá)miR-181a后，在低電流

14、刺激下，小鼠CFC記憶的鞏固過(guò)程顯著增強(qiáng)。隨后，我們發(fā)現(xiàn)，阻斷小鼠海馬腦區(qū)miR-181a并不影響小鼠的運(yùn)動(dòng)能力及焦慮樣行為。
　　3. miR-181a調(diào)控的靶基因篩選
　　我們首先采用Targetscan，miR-22，miRDB，microcosm這四種預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)miR-181a可能調(diào)控的靶基因。隨后采用KEGG分析方法，將每一種軟件預(yù)測(cè)出的眾多靶基因都用KEGG分析其所在的信號(hào)通路。最后將四種軟件的KEGG分析結(jié)果

15、取交集。我們發(fā)現(xiàn)所有預(yù)測(cè)出的信號(hào)通路中都包含mTOR信號(hào)通路。在mTOR信號(hào)通路中，PRKAA1和REDD1這兩個(gè)分子都被預(yù)測(cè)到可能受miR-181a的調(diào)控。我們通過(guò)luciferase reporter assay實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，PRKAA1和REDD1在細(xì)胞中受到miR-181a的調(diào)控，是miR-181a的靶基因。
　　4. PRKAA1和REDD1在CFC訓(xùn)練之后的表達(dá)下調(diào)受到miR-181a的調(diào)控
　　我們?nèi)a(i)

16、ve以及CFC訓(xùn)練后0小時(shí)，1小時(shí)，2小時(shí)，4小時(shí)和8小時(shí)小鼠的海馬腦區(qū)，檢測(cè)其中PRKAA1、REDD1和mTOR活性的變化情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在CFC訓(xùn)練后4小時(shí)，PRKAA1和REDD1的蛋白水平顯著下調(diào)，而mTOR活性水平顯著升高。當(dāng)阻斷小鼠海馬腦區(qū)的miR-181a后，小鼠海馬腦區(qū)的PRKAA1和REDD1蛋白水平顯著提升，而CFC訓(xùn)練刺激能夠顯著降低PRKAA1和REDD1的蛋白水平;當(dāng)阻斷miR-181a后再進(jìn)行CFC訓(xùn)練

17、刺激后小鼠海馬腦區(qū)的PRKAA1和REDD1蛋白水平則不再下調(diào)，而mTOR活性也不再升高。這個(gè)實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，在CFC訓(xùn)練后，小鼠海馬腦區(qū)的miR-181a能夠調(diào)控mTOR信號(hào)通路的蛋白變化。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)論:
　　1. 通過(guò)本課題的研究，我們發(fā)現(xiàn)miR-181a參與了小鼠海馬腦區(qū)的CFC記憶的鞏固過(guò)程。
　　2. 通過(guò)軟件預(yù)測(cè)和luciferase reporter assay實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)miR-181a能夠調(diào)控mTOR信號(hào)

18、通路中的兩個(gè)上游分子PRKAA1和REDD1。
　　3. 我們發(fā)現(xiàn)PRKAA1和REDD1能夠參與小鼠海馬腦區(qū)CFC記憶的鞏固過(guò)程。
　　4. 我們確定了在小鼠海馬腦區(qū)CFC訓(xùn)練過(guò)程中，上調(diào)的miR-181a能夠抑制靶蛋白PRKAA1和REDD1的表達(dá)，繼而激活mTOR蛋白，最終參與CFC記憶的鞏固過(guò)程。
　　5. 我們的實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步了解miRNA在學(xué)習(xí)記憶中的功能提供了理論基礎(chǔ)，為日后以miRNA為基礎(chǔ)治療臨床疾病提