鼠尾草酚通過(guò)激活SIRT1-EZH2信號(hào)通路減輕肝臟纖維化.pdf

1、肝纖維化（liver fibrosis）是多種慢性肝損害所致的可逆性病理改變，是肝硬化發(fā)展的必經(jīng)階段。其主要表現(xiàn)為肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell,HSC)激活所致的肝細(xì)胞外間質(zhì)成分過(guò)度異常沉積，影響肝臟的功能。目前肝纖維化在診治方面雖然有一些進(jìn)展，但仍缺乏確定有效的藥物，且相關(guān)分子機(jī)制尚不完全明確。有研究表明Enhancer of Zeste Homolog2(EZH2)在促進(jìn)肌成纖維細(xì)胞（myofibrobla

2、st，MFB）分化中發(fā)揮重要作用，但其具體機(jī)制仍不完全清楚。鼠尾草酚（carnosol，CS）是迷迭香中提取的一種脂溶性有效成分，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理活性，但其對(duì)肝纖維化的治療作用國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道。
　　目的:
　　探究CS對(duì)肝纖維化的保護(hù)作用，以及Sirtuin1(SIRT1)/EZH2在抗肝纖維化中的分子機(jī)制。
　　方法:
　　1.CS在大鼠肝纖維化中保護(hù)作用的研究
　　60只雄性Sprag

3、ue-Dawley大鼠隨機(jī)分為五組:(A)空白對(duì)照組;(B)CS空白給藥組(30mg/kg);(C)CCl4腹腔注射組;(D)CCl4+CS低劑量（15mg/kg）給藥組;(E)CCl4+CS高劑量(30mg/kg)給藥組。C、D、E組通過(guò)腹腔注射CCl4（0.5mg/kg，按1∶10比例稀釋于橄欖油中，2次/周，4周）模擬肝纖維化模型，A、B組給予等量溶媒橄欖油腹腔注射;同時(shí)，B、D、E組每天通過(guò)灌胃方式給予不同濃度CS油溶液，A、C

4、組給予等量溶媒橄欖油。四周后腹主動(dòng)脈取血，分離肝臟組織標(biāo)本。檢測(cè)大鼠血清中谷丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Alanine Aminotransferase，ALT)、谷草氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Aspartate Aminotransferase，AST）活性。采用蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)和Masson染色法檢查肝臟病理改變及膠原累積分布情況;通過(guò)Western Blot法檢測(cè)肝組織SIRT1、EZH2、CollagenⅠ、

5、α-SMA、E-Cadherin、Vimentin等蛋白水平;real-time PCR法檢測(cè)肝組織PPARγ、TIMP1、CTGF、CollagenⅠ、α-SMA等的mRNA水平。
　　2.CS對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（transforminggrowth factorβ1，TGFβ1）誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制研究
　　(1)AML-12、LX-2細(xì)胞分成四組:空白對(duì)照組;CS(10μM)組;TGFβ1（4ng/ml）組;

6、CS(10μM)+TGFβ1(4ng/ml)組。CS預(yù)給藥6h，TGFβ1誘導(dǎo)12h后提取細(xì)胞全蛋白。Western Blot法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)CollagenⅠ、α-SMA表達(dá)情況。
　　(2)AML-12、LX-2細(xì)胞分成五組:空白對(duì)照組;TGFβ1(4ng/ml)組;高、中、低劑量CS(2.5μM、5μM、10μM)+TGFβ1(4ng/ml)組。CS預(yù)處理6h，使用TGFβ1誘導(dǎo)12h后提取細(xì)胞全蛋白。Western Blot法

7、檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)CollagenⅠ、α-SMA蛋白表達(dá)水平。
　　(3)大鼠原代HSC、AML-12細(xì)胞分成四組:陰性對(duì)照(si-control)組;si-control+TGFβ1(4ng/ml)組;EZH2干擾(si-EZH2)組;si-EZH2+TGFβ1(4ng/ml)組。control siRNA/EZH2siRNA轉(zhuǎn)染48h,TGFβ1誘導(dǎo)12h后，提取細(xì)胞RNA或全蛋白。采用real-time PCR法檢測(cè)EZH2、PPA

8、Rγ、TIMP1、CTGF、CollagenⅠ、α-SMA的mRNA表達(dá)情況;Western Blot法檢測(cè)CollagenⅠ、α-SMA、E-Cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)水平;免疫熒光法觀察細(xì)胞中E-Cadherin、Vimentin的分布和表達(dá)情況。
　　(4)大鼠原代HSC、AML-12細(xì)胞分成五組:陰性對(duì)照(si-control)組;si-control+TGFβ1(4ng/ml)組;si-control+T

9、GFβ1(4ng/ml)+CS(10μM)組;SIRT1干擾(si-SIRT1)+TGFβ1(4ng/ml)組;si-SIRT1+TGFβ1(4ng/ml)+CS(10μM)組。control siRNA/SIRT1siRNA轉(zhuǎn)染48h、CS作用6h,TGFβ1誘導(dǎo)12h后，提取細(xì)胞全蛋白或RNA。采用Western Blot法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)SIRT1、EZH2、CollagenⅠ、α-SMA、E-Cadherin及Vimentin蛋白表達(dá)

10、情況;real-time PCR技術(shù)檢測(cè)PPARγ、TIMP1、CTGF、CollagenⅠ、α-SMA的mRNA表達(dá)水平;免疫熒光方法觀察細(xì)胞中E-Cadherin、Vimentin的分布和表達(dá)情況。
　　(5)AML-12細(xì)胞分成四組:陰性對(duì)照(si-control)組;si-control+CS(10μM)組;SIRT1干擾（si-SIRT1）組;si-SIRT1+CS(10μM)組。control siRNA/SIRT1s

11、iRNA轉(zhuǎn)染48h，CS作用6h后Western Blot法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)SIRT1及EZH2的蛋白表達(dá)情況，免疫沉淀法檢測(cè)EZH2蛋白的乙?；健?br>　　(6)AML-12細(xì)胞分成五組:陰性對(duì)照組(si-control);si-control+TGFβ1(4ng/ml)組;si-control+TGFβ1(4ng/ml)+白藜蘆醇(resveratrol，Res，10μM)組;si-control+TGFβ1(4ng/ml)+CS(

12、10μM)組;si-SIRT1+TGFβ1(4ng/ml)。control siRNA/SIRT1siRNA轉(zhuǎn)染48h后，CS/Res作用6h，TGFβ1誘導(dǎo)12h，提取細(xì)胞全蛋白或RNA。Western Blotting法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)SIRT1及EZH2蛋白表達(dá)情況;免疫沉淀法檢測(cè)EZH2蛋白的乙酰化水平。
　　(7)大鼠原代HSC、AML-12細(xì)胞分成四組:陰性對(duì)照(pcDNA3.1)組;pcDNA3.1+TGFβ1(4ng/m

13、l)組;pcDNA3.1+TGFβ1(4ng/ml)+Res(10μM)組;EZH2過(guò)表達(dá)(pcDNA-EZH2)+TGFβ1(4ng/ml)+Res(10μM)組;轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/pcDNA-EZH248h后，Res作用6h，TGFβ1誘導(dǎo)12h。提取細(xì)胞RNA或全蛋白，采用real-time PCR技術(shù)檢測(cè)TIMP1、CTGF、CollagenⅠ、α-SMA的mRNA表達(dá)水平;Western Blot法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)E-Cadhe

14、rin及Vimentin蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化引起大鼠血清中ALT、AST上升，正常肝小葉結(jié)構(gòu)喪失、炎癥滲出、肝細(xì)胞排列紊亂、大量膠原纖維增生;CS治療后能明顯改善上述情況。CS上調(diào)肝組織中SIRT1，下調(diào)EZH2，抑制HSC激活及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)。機(jī)制上，CS對(duì)肝纖維化的保護(hù)作用與SIRT1的激活相關(guān):上調(diào)SIRT1能通過(guò)抑制EZH2的乙?；磉_(dá)，影響其穩(wěn)定性，從而減弱HSC激活及EM