mTOR在人腦膠質瘤中的表達及意義.pdf

1、前言: 腦膠質細胞瘤是最常見的原發(fā)性中樞神經系統(tǒng)惡性腫瘤，約占成人原發(fā)性顱內腫瘤的50％-60％。在治療上，以手術治療為主，因腫瘤浸潤性生長，多數(shù)腫瘤與正常腦組織無明確的界限，不能徹底切除，因而術后多需要進行放射治療、化學治療等多種輔助療法。由于惡性腫瘤的生物學特性，即使進行了綜合治療，腦膠質瘤術后復發(fā)幾乎也是不可避免的。TOR(雷帕霉素靶蛋白)最初是1991年在酵母的突變株TOR1-1和TOR2-1中被發(fā)現(xiàn)。1994年，Bro

2、wn等證實并克隆了哺乳動物TOR基因，其產物只有一種蛋白，即mTOR(哺乳動物雷帕霉素靶蛋白，也被稱為FRAP、RAFT、RAPT)。人mTOR基因定位于1p36.2，編碼的蛋白質由2549個氨基酸組成，分子量是280kDa。研究表明mTOR在細胞的增殖、生長、分化過程中起著中心調控點的作用。此外，相關研究證實其在腫瘤的形成、發(fā)展過程，也起著重要作用。本實驗采用逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)以及westem blot的方法探討mTO

3、R的表達與腦膠質瘤的惡性程度或組織學分級的關系。 實驗材料: 選擇選取中國醫(yī)科大學第一臨床學院神經外科2006年12月至2007年6月間手術切除的人腦膠質瘤組織標本35例，其中男21例，女14例，年齡20～74歲，平均年齡46歲。根據WHO(2001年)關于人腦膠質瘤病理分類方法：包括Ⅰ級6例，Ⅱ級15例，Ⅲ級9例，Ⅳ級5例。所有患者術前均未接受放療、化療或其他任何可能對腫瘤生物學特性的干預性治療。 主要試劑：P

4、CR引物(大連寶生物公司)；DNA分子量標準(大連寶生物公司)；硝酸纖維素膜(美國Millipore公司)；兔抗人mTOR(美國Biochemicals公司)；堿性磷酸酶標記的山羊抗兔二抗(北京中山公司)；鼠抗β-actin(美國Sigma公司)等。 主要儀器：高速冷凍離心機(Sigma 3C15K美國)；PCR儀(Biometra Unio Ⅱ型，德國)；多功能電泳儀(北京六一儀器廠)；紫外分光光度計(UV3000,英國)；凝

5、膠自動成像及分析系統(tǒng)(Chemi Imager,美國)；轉印電泳槽(北京六一儀器廠)等。 實驗方法: 1、RT-PCR采用Trizol試劑一步法提取組織總RNA，紫外分光光度計測定純度并定量。根據GenBank提供的mTOR和內參照β-actin的mRNA序列，應用軟件Primer Premier5.0自行設計引物。反應條件：94℃ 5min，一個循環(huán)；94℃，30s,55℃ 30 s,72℃1min，35個循環(huán)；72℃

6、 5min后結束擴增反應。取PCR產物與上樣緩沖液混合，進行2％瓊脂糖凝膠電泳，120V,30min，電泳結束后，凝膠成像儀成像分析。 2、Western blot提取樣品蛋白，進行樣品蛋白定量并進行濃度調整，電泳，轉印，用抗mTOR抗體和抗β-actin抗體孵育，最后加入堿性磷酸酶標記的相應二抗，加入顯色劑顯色后記錄結果，并用凝膠成像儀分析圖像。 3、統(tǒng)計學分析凝膠圖像分析系統(tǒng)進行灰度分析，mTOR基因的表達值以(mT

7、OR的光密度值/β-actin吸光度值)×100％表示，結果以-x±s表示。應用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗，兩樣本率的比較用X2檢驗，P<0.05有統(tǒng)計學意義。 實驗結果: 本研究結果顯示：30例人腦膠質瘤樣本中有mTOR的mRNA以及蛋白的表達，Ⅰ級，Ⅱ級，Ⅲ級，Ⅳ級膠質瘤組織中mTOR的表達率無顯著性差異。隨腫瘤惡性程度的增高mTOR的mRNA以及蛋白的表達均有所增高，Ⅰ級，Ⅱ級，Ⅲ級

8、，Ⅳ級膠質瘤中組織中mTOR的mRNA以及蛋白表達值相互比較，差異顯著。 討論: 膠質瘤的發(fā)病機制非常復雜，很多基礎研究期望從基因水平尋求治療膠質瘤的突破口。mTOR是近年來發(fā)現(xiàn)的一類進化上非常保守的蛋白激酶家族，廣泛存在于各種生物細胞中。最近對其復合物功能的研究對腫瘤和代謝性疾病的發(fā)病機制提供了合理的解釋。既往研究表明，在多數(shù)腫瘤組織中mTOR高表達，如前列腺癌、乳腺癌、肝癌、腮腺癌、膽管癌以及白血病等。以上研究結果提

9、示mTOR高表達可能與腫瘤形成和細胞增殖活躍密切相關。本實驗結果表明，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白mTOR在人腦膠質瘤組織中基因及蛋白水平的表達值增高，并且隨腫瘤惡性程度的增高mTOR的mRNA以及蛋白的表達值均有所增高，Ⅰ級，Ⅱ級，Ⅲ級，Ⅳ級膠質瘤中組織中mTOR的mRNA以及蛋白表達值相互比較，差異顯著。雷帕霉素及其衍生物作為mTOR特異性抑制劑在腫瘤治療中的作用已引起廣泛關注，其中關于前列腺癌、乳腺癌、胃腸道間質的腫瘤治療研究已進入Ⅰ期