豬呼吸道上皮細(xì)胞體外分化模型的建立及其應(yīng)用研究.pdf

1、背景:目前體外分化的人呼吸道上皮細(xì)胞(Human airway epithelial cell，HAEC)已被廣泛應(yīng)用于新發(fā)呼吸道病毒的鑒定、宿主與呼吸道病原體間相互作用和呼吸系統(tǒng)疾病的研究中。豬是許多人呼吸道病毒感染的天然宿主，在肺生理學(xué)、呼吸道形態(tài)學(xué)和呼吸道細(xì)胞類型以及受體分布都與人類有相似之處，因此豬可作為研究呼吸道病毒感染和呼吸系統(tǒng)疾病藥物篩選的理想模型。
　　目的:構(gòu)建豬呼吸道上皮細(xì)胞（Porcine airway ep

2、ithelial cell，PAEC）體外分化模型，鑒定其形態(tài)學(xué)和生理學(xué)特征及其在轉(zhuǎn)導(dǎo)外源基因方面的應(yīng)用。
　　方法:本研究采用蛋白酶低溫消化分離豬氣管和支氣管上皮細(xì)胞，接種至Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白包被的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，使用添加多種細(xì)胞生長(zhǎng)因子的無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行原代培養(yǎng)。細(xì)胞接種至Ⅳ型膠原蛋白包被的半透膜支持物上，采用氣液界面培養(yǎng)法進(jìn)行豬呼吸道上皮細(xì)胞的體外分化培養(yǎng)。采用掃描電鏡法、電生理和免疫組化等方法檢測(cè)和鑒定培養(yǎng)物的細(xì)胞組成和形態(tài)學(xué)

3、特性以及其表面典型的細(xì)胞標(biāo)志蛋白。腺相關(guān)病毒(Adenoassociated virus，AAV)具有免疫原性低和可介導(dǎo)外源基因長(zhǎng)期表達(dá)的特性，在基因治療領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用空間。本實(shí)驗(yàn)研究中將pXX680，pXR6，PSC-GFP三種質(zhì)粒按照6∶5∶3的比例轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，培養(yǎng)48h后，收獲含重組腺相關(guān)病毒rAAV6-GFP的293T細(xì)胞。利用兩步氯化銫梯度離心純化重組rAAV6-GFP病毒并感染分化成熟的豬呼吸道上皮細(xì)胞，研究AAV

4、6在該模型上的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，驗(yàn)證AAV6能否有效地介導(dǎo)外源基因表達(dá)。
　　結(jié)果:結(jié)果顯示分化成熟的PAEC模型為多層上皮結(jié)構(gòu)，其頂端表面含有纖毛細(xì)胞、黏液分泌細(xì)胞和基底層細(xì)胞。PAEC模型的電生理學(xué)特性-上皮細(xì)胞跨膜電阻在一定時(shí)期內(nèi)保持穩(wěn)定，表明PAEC細(xì)胞間連接的形成和跨細(xì)胞間離子運(yùn)輸?shù)钠胶?。本研究通過(guò)三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染法成功制備了重組腺相關(guān)病毒rAAV6-GFP，其能夠通過(guò)頂端表面感染PAEC，有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)呼吸道上皮細(xì)胞。
　　結(jié)論