呼吸道合胞病毒感染后氣道上皮細(xì)胞株Toll樣受體表達(dá)及其功能研究.pdf

1、目的：為了解TLR家族在RSV誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用，體外培養(yǎng)9HTEo人類(lèi)氣道上皮細(xì)胞株，觀察RSV感染后，9HTEo細(xì)胞TLR1-10 mRNA的表達(dá)變化。 方法：RSV以MOI為10感染9HTEo細(xì)胞3小時(shí)后用半定量RT-PCR檢測(cè)TLR1-10 mRNA表達(dá)；感染3、6和9小時(shí)后用Q-PCR檢測(cè)TLR1-10 mRNA的動(dòng)態(tài)變化，并以UV-RSV作為對(duì)照。 結(jié)果：RT-PCR結(jié)果提示RSV感染上皮細(xì)胞后

2、TLR2～10mRNA表達(dá)均上調(diào)，以TLR2和TLR6變化最為顯著；Q-PCR結(jié)果顯示：（1）9HTEo細(xì)胞株可表達(dá)TLR1-10 mRNA，其中以TLR4和TLR8 mRNA表達(dá)最高；（2）RSV感染上皮細(xì)胞6小時(shí)和＼或9小時(shí)后，TLR1-10mRNA均表達(dá)增高，而UV-RSV組TLRl-10mRNA無(wú)明顯變化。 結(jié)論：RSV感染氣道上皮細(xì)胞株后，TLR1-10 mRNA均被上調(diào)，而無(wú)復(fù)制能力的RSV不能引起TLR1-10mR

3、NA表達(dá)的變化，提示RSV誘導(dǎo)TLRs mRNA表達(dá)與病毒入胞復(fù)制有關(guān)。 目的：觀察RSV感染后，氣道上皮細(xì)胞TLR4蛋白表達(dá)變化及其信號(hào)通路的功能，與RSV在細(xì)胞復(fù)制的關(guān)系，進(jìn)一步探討RSV誘導(dǎo)氣道炎癥的可能機(jī)制。 方法：體外培養(yǎng)人類(lèi)氣管上皮細(xì)胞株9HTEo-，RSV以MOI為10感染上皮細(xì)胞24小時(shí)后（1）用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TLR4表達(dá)及與凋亡的關(guān)系；（2）用ELISA檢測(cè)RSV感染上皮細(xì)胞經(jīng)LPS刺激，并加入TLR4

4、阻斷劑HTA125后，上清液中IL-8，IL-6和RANTES的含量；（3）運(yùn)用TLR4特異性的siRNA干擾9HTEo細(xì)胞TLR4表達(dá)后，接種RSV并予以LPS刺激，用ELISA法檢測(cè)上清液中IL-8，IL-6的水平。用TLR4特異性siRNA干擾9HTEo細(xì)胞24小時(shí)后，①RSV以MOI為0.1感染細(xì)胞，連續(xù)3天收集上清液用Adeasy TCID50法檢測(cè)RSV感染性滴度的變化；②RSV以MOI為10感染細(xì)胞48小時(shí)，ELISA方法

5、檢測(cè)上清液中IL-8，IL-6，TNF-α和MCP-1的變化；③RSV以MOI為10感染細(xì)胞24小時(shí)后，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。 結(jié)果：RSV感染9HTEo上皮細(xì)胞，膜上TLR4表達(dá)增高而胞內(nèi)TLR4表達(dá)降低，TLR4陽(yáng)性細(xì)胞百分比明顯增加，其中絕大部分為膜Annexin V陽(yáng)性細(xì)胞；LPS誘導(dǎo)的IL-6和部分IL-8可被HTA125阻斷，RANTES無(wú)明顯變化；在TLR4表達(dá)被干擾的情況下，LPS刺激僅能誘導(dǎo)產(chǎn)生部分IL

6、-8，不能誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-6。TLR4-siRNA組的RSV滴度變化與正常9HTEo細(xì)胞組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；RSV誘導(dǎo)的IL-6和MCP-1水平在TLR4-siRNA200nM組明顯低于對(duì)照組，而IL-8和TNF-α的水平無(wú)明顯變化；TLR4-siRNA組RSV誘導(dǎo)AnnexinV陽(yáng)性同時(shí)PI陰性的細(xì)胞群體百分比在TLR4-siRNA組明顯高于對(duì)照細(xì)胞組。 結(jié)論：RSV感染9HTEo細(xì)胞后，LPS再刺激產(chǎn)生IL-6是依賴(lài)于TLR4信號(hào)

7、通路。氣道上皮細(xì)胞TLR4通路與RSV復(fù)制、RSV誘導(dǎo)上皮細(xì)胞分泌IL-8無(wú)關(guān)，但與病毒誘導(dǎo)上皮細(xì)胞分泌IL-6和MCP-1，以及病毒感染細(xì)胞發(fā)生凋亡有關(guān)。 目的：觀察RSV感染9HTEo上皮細(xì)胞后，TLR3蛋白表達(dá)變化及其信號(hào)通路的功能。 方法：體外培養(yǎng)人類(lèi)氣管上皮細(xì)胞株9HTEo-，RSV（1）以MOI為1感染上皮細(xì)胞24小時(shí)后，提取細(xì)胞總蛋白，用Westernblot的方法檢測(cè)TLR3表達(dá)的變化，以TLR3激動(dòng)劑P

8、olyIC刺激為對(duì)照；（2）以MOI為10接種上皮細(xì)胞4小時(shí)后，直接加入PolyIC到培養(yǎng)上清或用脂質(zhì)體將PolyIC轉(zhuǎn)染至細(xì)胞內(nèi)刺激48小時(shí)后，用ELISA檢測(cè)上清液中IL-8，IL-6，IFN-α和IFN-β的表達(dá)。 結(jié)果：RSV感染后9HTEo上皮細(xì)胞后，TLR3蛋白表達(dá)量明顯增高，再經(jīng)胞內(nèi)TLR3激動(dòng)劑PolyIC刺激后，培養(yǎng)上清IL-8，IL-6和IFN-β含量明顯增加。 結(jié)論：RSV誘導(dǎo)上皮細(xì)胞TLR3蛋白表

9、達(dá)增高，TLR3通路可介導(dǎo)IL-8和IL-6和少量IFN-β產(chǎn)生，提示TLR3通路可能主要誘導(dǎo)上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)而不是抗病毒反應(yīng)。 目的：以地塞米松和利巴韋林為對(duì)照，觀察白藜蘆醇對(duì)RSV復(fù)制和對(duì)RSV誘導(dǎo)的上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)作用及其機(jī)制研究。 方法：（1）體外培養(yǎng)人類(lèi)氣管上皮細(xì)胞株9HTEo-細(xì)胞和Hep-2細(xì)胞株，RSV以MOI為0.1接種Hep-2細(xì)胞和9HTEo細(xì)胞4小時(shí)后，加入適宜濃度的白藜蘆醇，地塞米松和利巴韋林，

10、連續(xù)5天收集各組上清液，用AdeasyTCID50方法檢測(cè)計(jì)算RSV滴度的變化；（2）體外培養(yǎng)人類(lèi)氣管上皮細(xì)胞株9HTEo-細(xì)胞，RSV以MOI為10接種9HTEo細(xì)胞4小時(shí)，將PolyIC轉(zhuǎn)染至細(xì)胞內(nèi)后再加入適宜濃度白藜蘆醇，地塞米松或利巴韋林至48小時(shí)后，用ELISA檢測(cè)上清液中IL-8，IL-6的表達(dá)。（3）體外培養(yǎng)人類(lèi)氣管上皮細(xì)胞株9HTEo-細(xì)胞，RSV以MOI為1接種9HTEo細(xì)胞4小時(shí)，加入適宜濃度白藜蘆醇，地塞米松或利巴

11、韋林，48小時(shí)后收集細(xì)胞提取蛋白用Westernblot檢測(cè)TLR3蛋白，TRIF蛋白和TBK-1蛋白表達(dá)的變化。 結(jié)果：Hep-2細(xì)胞-白藜蘆醇100μM處理組和9HTEo細(xì)胞-白藜蘆醇處理組的RSV滴度明顯低于單純RSV組，相應(yīng)細(xì)胞的地塞米松處理組的RSV滴度無(wú)明顯變化，而利巴韋林組的RSV滴度明顯低于單純RSV組。RSV感染9HTEo細(xì)胞后，白藜蘆醇組和地塞米松組的IL-6水平明顯降低，但I(xiàn)L-8無(wú)明顯變化，利巴韋林組的I

12、L-8和IL-6水平明顯降低；RSV感染9HTEo細(xì)胞后再給與胞內(nèi)PolyIC刺激后，白藜蘆醇組，地塞米松組的IL-8和IL-6水平均明顯降低，而利巴韋林組IL-8和IL-6無(wú)明顯變化。RSV感染9HTEo細(xì)胞后，白藜蘆醇處理組的TRIF蛋白和TBK-1蛋白表達(dá)明顯降低，TLR3蛋白無(wú)明顯變化；地塞米松組和利巴韋林組的TLR3蛋白，TRIF蛋白和TBK-1蛋白的表達(dá)均明顯降低。 結(jié)論：白藜蘆醇可抑制RSV在氣道上皮細(xì)胞中的復(fù)制和