腦膜癌病小鼠模型的建立.pdf

1、目的：
　　腦膜癌?。↙eptomeningeal carcinomatosis，LC）是原發(fā)腫瘤細胞轉移，局灶或彌漫浸潤軟腦膜及蛛網(wǎng)膜下腔，并播散至腦脊液，是惡性腫瘤中樞神經(jīng)系統(tǒng)轉移的一種較少見類型，原發(fā)病灶常為肺癌，腺癌是常見的組織學類型。近年來，腦膜癌病的發(fā)病率呈上升趨勢，而目前該病的治療效果尚不理想，尚缺乏針對原發(fā)腫瘤不同來源及病理特征的有效治療手段。為進一步探索相關治療靶點，以及評估相關治療藥物及方法的有效性及安全性，首

2、先需要建立穩(wěn)定的實驗動物模型。目前腦膜癌病動物模型的研究報道較少，國外研究者較早通過小腦延髓池（Cisterna magna，CM）穿刺進行的腦膜癌病大鼠模型的實驗性研究及鞘內給藥方式需要較復雜的操作過程。本實驗通過對早期腦膜癌病動物模型的實驗方法進行改進，旨在建立操作簡單、重復性較好的腦膜癌病小鼠模型，并進一步探討模型小鼠腦膜腫瘤中血小板-內皮細胞粘附分子（Platelet endothelial cell adhesion mole

3、cule-1，CD31）的表達情況。
　　方法：
　　1小鼠小腦延髓池注射法
　　雌性6-8周齡C57BL/6小鼠35只，其中20只隨機分為對照組和實驗組，每組10只，分別經(jīng)小腦延髓池穿刺注射PBS或Lewis肺癌細胞（Lewis Lung carcinoma cell，LLC）懸液（1.5×105個細胞）7.5μl，觀察評估小腦延髓池注射后兩組小鼠體重隨時間變化及神經(jīng)系統(tǒng)癥狀表現(xiàn)；15只隨機分為正常對照組（n=3）、

4、PBS組（n=6）和模型組（n=6），當小鼠癥狀表現(xiàn)明顯時，4％多聚甲醛灌流固定取材，小鼠腦和脊髓組織用于組織病理學蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining，HE）及免疫組化分析。
　　2石蠟切片HE染色法
　　4%多聚甲醛固定后的小鼠腦和脊髓組織標本經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋后制成蠟塊，用Leica RM2235石蠟切片機切片，切片厚度為5μm。切片經(jīng)脫蠟后進行常規(guī)HE染色，組織病理學觀察軟腦（

5、脊）膜病理改變。
　　3免疫組織化學法
　　采用免疫組化方法對模型組及PBS組小鼠橋腦部位的軟腦膜進行 CD31染色分析，評估腦膜癌病血管生成。
　　結果：
　　1小鼠經(jīng)小腦延髓池緩慢注射10μl稀釋的墨汁溶液后，解剖小鼠腦及脊髓，可見墨汁溶液主要分布于小腦延髓池、腹側腦池。
　　2小腦延髓池注射LLC細胞或PBS后兩組小鼠行為學觀察
　?。?）小腦延髓池注射前對照組小鼠體重為（18.68±1.08）

6、g，實驗組小鼠體重為（19.43±0.86）g，兩組比較差異無統(tǒng)計學意義（P=0.101）。小腦延髓池注射PBS或LLC細胞懸液后第1天，兩組小鼠體重均下降明顯，對照組小鼠體重為（17.02±1.63）g，實驗組小鼠體重為（17.08±1.06）g，兩組比較差異無統(tǒng)計學意義（P=0.921）。第2~3天，兩組小鼠體重水平仍較低，較前變化不大。第4~10天，兩組小鼠體重均緩慢回升，差異無統(tǒng)計學意義（P﹥0.05）。第11天開始，對照組小鼠

7、體重仍在逐漸增加，而實驗組小鼠體重開始進行性下降直至死亡，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（P=0.029）。實驗組小鼠均在40天內死亡，中位生存時間為32.5天，而對照組小鼠均至觀察終點40天仍存活，差異具有統(tǒng)計學意義（P﹤0.0001）。
　　（2）實驗組小鼠小腦延髓池注射LLC細胞后癥狀出現(xiàn)在第10~16天，平均為（13±2）天。全部實驗組（n=10）小鼠均表現(xiàn)為活動明顯減少，全身狀態(tài)差（10/10）；其中6只小鼠病程中出現(xiàn)了弓背姿

8、勢（6/10）；5只小鼠出現(xiàn)步態(tài)不穩(wěn)（5/10）；2只小鼠出現(xiàn)拎起尾巴旋轉的表現(xiàn)（2/10）。而對照組小鼠均活動正常，未出現(xiàn)上述異常表現(xiàn)。
　　3蘇木精-伊紅染色顯示模型組小鼠癥狀表現(xiàn)明顯時其腦與脊髓軟膜組織病理可見腫瘤細胞浸潤，以腦基底部及脊髓頸段多見。
　　4免疫組化結果顯示CD31在模型組及PBS組小鼠橋腦部位軟腦膜的表達明顯不同，實驗組血管計數(shù)約為（12.83±3.01）mm-1，對照組為（6.08±1.02）mm-

9、1，差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.021）。
　　結論：
　　1通過小腦延髓池注射Lewis肺癌細胞可成功建立肺癌腦膜癌病小鼠模型，實驗方法簡單、重復性較好。
　　2腦膜癌病模型小鼠病程中可出現(xiàn)體重進行性下降、活動明顯較少、全身狀態(tài)差、弓背姿勢、步態(tài)不穩(wěn)、拎起尾巴時旋轉等異常癥狀表現(xiàn)，但各小鼠表現(xiàn)不盡相同。
　　3腦膜癌病模型小鼠的軟腦膜部位CD31的表達明顯增多，表明腦膜血管密度增多，提示新生微血管形成可能在腦膜