Snail調(diào)控HID1的機(jī)制及HID1對胰腺癌細(xì)胞遷移的影響.pdf

1、目的：本論文系統(tǒng)研究轉(zhuǎn)錄因子Snail在胰腺癌細(xì)胞中對HID1基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及HID1基因?qū)σ认侔┘?xì)胞遷移的抑制作用。胰腺癌是目前最致命的實(shí)體惡性腫瘤之一，具有侵襲性，診斷遲，抵抗放化療等特點(diǎn)。最近研究表明Snail在腫瘤轉(zhuǎn)移和發(fā)展過程中具有重要作用。Snail屬于鋅指轉(zhuǎn)錄因子，其羧基端的DNA結(jié)合區(qū)能夠與靶基因的E-box(CANNTG)序列相結(jié)合，從而抑制其轉(zhuǎn)錄。Snail氨基末端的SNAG調(diào)節(jié)區(qū)能夠招募多種輔阻遏物抑制其靶基因的

2、表達(dá)并誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(EMT)。在EMT過程中， Snail主要通過下調(diào)上皮細(xì)胞標(biāo)志物，例如上皮性鈣黏蛋白(E-cadherin)以及上調(diào)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物，例如神經(jīng)性鈣黏蛋白(N-cadherin)、纖維粘連蛋白(fibronectin)、波形蛋白(vimentin)等來促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)移。HID1基因是在胰腺癌組織中用組蛋白H2AK119Ub1的抗體做ChIP-seq實(shí)驗檢測到的。HID1是首先在線蟲的高溫誘導(dǎo)休眠突變體中被發(fā)現(xiàn)的外周

3、膜蛋白，其功能涉及神經(jīng)肽分選及囊泡的成熟和運(yùn)輸。另外有文獻(xiàn)報道HID1在多種腫瘤細(xì)胞中低表達(dá)，但其對細(xì)胞遷移的影響卻未見報道。而軟件預(yù)測HID1的啟動子中含有E-box序列，因此我們推測HID1可能是Snail的一個靶基因。
　　方法:為了研究Snail是否調(diào)控HID1，我們在多種腫瘤細(xì)胞中構(gòu)建了Snail過表達(dá)及敲低的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，并用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)檢測Snail對HID1mRNA表達(dá)的影響。為了進(jìn)一步驗證Snail對HI

4、D1的調(diào)控作用，我們構(gòu)建了HID1啟動子的熒光素酶報告基因質(zhì)粒和其E-box序列突變質(zhì)粒。在HEK293T細(xì)胞中，共轉(zhuǎn)染Snail與熒光素酶報告基因質(zhì)粒，并檢測Snail對HID1啟動子活性的影響。為了證實(shí)Snail是否與HID1啟動子上的兩個E-box直接結(jié)合，我們進(jìn)行了染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗。接下來我們檢測了調(diào)控組蛋白H2AK119泛素化的Ring1A及EZH2敲低后對HID1表達(dá)的影響。下一步我們進(jìn)行了HID1的功能研究。我們首先在

5、胰腺導(dǎo)管癌細(xì)胞PANC-1中構(gòu)建了HID1過表達(dá)和敲低的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，并在胰腺導(dǎo)管癌細(xì)胞PATU8988中構(gòu)建了共同過表達(dá)HID1和Snail的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。蛋白質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗檢測EMT標(biāo)志物的表達(dá)變化，transwell實(shí)驗檢測細(xì)胞遷移能力的變化。最后，我們用實(shí)時熒光定量PCR檢測了胰腺癌與癌旁組織中HID1的表達(dá)。
　　結(jié)果:在多種腫瘤細(xì)胞中，過表達(dá)Snail能夠顯著抑制HID1基因的轉(zhuǎn)錄，敲低Snail能夠顯著增強(qiáng)HID1的轉(zhuǎn)

6、錄。熒光素酶報告基因?qū)嶒烇@示Snail能夠顯著抑制HID1啟動子的活性。染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗證明Snail能夠直接與HID1啟動子上的兩個E-box直接結(jié)合，HID1是Snail的直接靶基因。此外，調(diào)控組蛋白H2AK119Ub1表達(dá)的多梳抑制家族蛋白Ring1A及EZH2的敲除都能夠增強(qiáng)HID1的表達(dá)，說明HID1受Snail/Ring1及Snail/EZH2復(fù)合物所調(diào)控。在胰腺癌細(xì)胞中過表達(dá)HID1能夠降低vimentin的表達(dá)，抑制

7、細(xì)胞遷移;敲低HID1能夠升高vimentin的表達(dá)，降低E-cadherin的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞遷移。在共同過表達(dá)Snail和HID1的PATU8988細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)HID1能夠阻斷Snail誘導(dǎo)的vimentin的升高，但卻無法完全阻斷Snail對細(xì)胞遷移的促進(jìn)作用。最后在19對胰腺癌和癌旁組織中發(fā)現(xiàn)HID1在胰腺癌組織中顯著性低表達(dá)。
　　結(jié)論:我們的結(jié)果表明HID1是Snail的一個直接靶基因并且HID1能夠作為胰腺癌細(xì)胞