miR-365在胰腺癌中表達及其對胰腺癌惡性進展的實驗研究.pdf

1、背景：
　　胰腺癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，是所有類型的實體腫瘤中最具有侵襲破壞性的腫瘤，目前胰腺癌已經(jīng)成為危害國民健康的一大憂患。由于胰腺癌患者早期缺乏特異的臨床表現(xiàn)及早期診斷標志物，發(fā)現(xiàn)時候大部分已是晚期，因伴隨腫瘤的遠端轉(zhuǎn)移與局部廣泛侵潤，患者生存時間極短。雖然隨著胰腺癌手術技術水平的不斷提高，手術應用越來越廣泛，然而，也只有10％-20％的早期胰腺癌患者可以行手術治療;雖然臨床研發(fā)的化療藥物層出不窮，但因胰腺癌存在多種

2、化療藥物抵抗與耐藥，導致患者治療效果十分不佳。因此，更深入的探討了解胰腺癌的發(fā)病機制，尋找新的胰腺癌特異有效的腫瘤標準物，對提高患者的早期診斷及療效、改善預后具有深遠意義。
　　目的：
　　本研究旨在分析miR-365在胰腺癌中表達及其作為胰腺癌腫瘤標志物的可能性，研究miR-365在胰腺癌細胞生長增殖及侵襲中的作用。通過收集臨床胰腺癌患者組織、血清及臨床病理資料，進行以下幾個問題的探討:1、miR-365在胰腺癌患者癌組織

3、及癌旁正常組織、胰腺癌患者及健康體檢者血清表達水平;2、評估血清miR-365區(qū)分胰腺癌患者與健康體檢者的效能。3、體外細胞實驗觀察胰腺癌細胞系及正常胰腺細胞miR-365表達水平;4、上調(diào)或下調(diào)胰腺癌細胞中miR-365表達，觀察對胰腺癌細胞增殖及侵襲的影響;5通過生物信息學軟件分析及熒光素酶報告基因預測與驗證miR-365的下游靶基因。
　　材料與方法：
　　1，本研究90例胰腺癌患者癌組織標本及其癌旁正常組織，均為20

4、13年8月至2016年8月鄭州大學第一附屬醫(yī)院肝膽外科收治的住院手術患者，獲得患者本人的同意，均未接受任何治療，排除其他系統(tǒng)腫瘤，所有的胰腺癌組織經(jīng)過病理確診證實，癌旁組織經(jīng)病理證實無腫瘤細胞浸潤。選取三株胰腺癌細胞系與一株正常胰腺細胞系，采用qRT-PCR分別檢測胰腺癌組織與癌旁組織、胰腺癌細胞系及正常胰腺細胞系miR-365表達水平。分析比較胰腺癌患者組織miR-365表達水平與腫瘤的分期、轉(zhuǎn)移等關系。
　　2，本研究70例胰

5、腺癌患者均為2010年11月至2013年11月鄭州大學第一附屬醫(yī)院肝膽外科收治的住院手術患者，征得患者本人同意，60例健康體檢者作為健康對照，均抽取3mL外周血，離心收集血清。qRT-PCR檢測胰腺癌患者與健康體檢者血清miR-365表達水平;采用ROC曲線評估血清miR-365區(qū)分胰腺癌與健康對照的敏感度與特異性，COX回歸分析胰腺癌患者總體生存的獨立預后因子，采用卡方x2檢驗分析胰腺癌患者血清miR-365相對表達量與胰腺癌患者臨床

6、病理之間的關系。
　　3，MTT及Transwell法觀察胰腺癌細胞轉(zhuǎn)染miR-365后細胞增殖及侵襲的變化。信息生物學軟件分析及熒光素酶報告基因預測并驗證miR-365靶基因，Western blot觀察上調(diào)miR-365對其靶基因蛋白表達的影響。
　　研究結(jié)果
　　1，胰腺癌患者癌組織miR-365的表達及臨床意義
　　qRT-PCR分析胰腺癌組織及正常癌旁組織、胰腺癌細胞系及正常胰腺細胞系中miR-365的

7、表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相對于正常癌旁組織及正常胰腺細胞系，miR-365在胰腺癌組織及胰腺癌細胞系表達顯著下調(diào)。本研究將胰腺癌組織miR-365表達水平與胰腺癌患者臨床病理信息進行分析，以探討胰腺癌患者癌組織中miR-365的表達水平與胰腺癌惡性進展的關系。結(jié)果顯示，胰腺癌組織miR-365表達水平與腫瘤大小與位置均無相關性(P＞0.05)。發(fā)生轉(zhuǎn)移的胰腺癌患者癌組織miR-365表達水平顯著低于未發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者(P＜0.05)，腫瘤高分化

8、的胰腺癌患者癌組織miR-365表達水平顯著高于低分化的患者(P＜0.05)。
　　2，胰腺癌患者血清中miR-365的表達水平及其潛在的診斷價值
　　利用qRT-PCR檢測胰腺癌患者及健康體檢者血清中miR-365表達水平，結(jié)果顯示，胰腺癌患者血清miR-365表達水平（1.18±0.07）顯著低于健康體檢者（4.14±0.168），差異顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.001），胰腺癌患者血清miR-365表達模式，與胰腺癌患者癌

9、組織及胰腺癌細胞水平表達模式一致。胰腺癌患者血清miR-365表達水平與胰腺癌腫瘤臨床轉(zhuǎn)移情況及腫瘤分化、分期密切相關，進一步提示miR-365可能在胰腺癌惡性進展中發(fā)揮至關重要的作用。血清miR-365可對健康體檢者與胰腺癌患者進行區(qū)別診斷，具有82.9％特異性，和78.3％的敏感度。相對于miR-365低表達胰腺癌患者，血清miR-365高表達組患者術后總體生存時間更長，提示血清miR-365可對胰腺癌患者術后總體生存進行評估。CO

10、(Ⅹ)回歸分析顯示胰腺癌預后相關因素miR-365表達水平(RR=3.59，95％ CI:1.81-7.36， P=0.001)，臨床分期(RR=1.82，95％ CI:1.12-4.87，P=0.005)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)（RR=1.11，95％ CI:1.04-3.66，P=0.004）是影響胰腺癌患者總體生存的獨立預后因子。
　　3，miR-365對胰腺癌侵襲的影響及下游靶基因預測
　　胰腺癌細胞AsPC-1分別進行an

11、ti-miR-365及anti-miR-NC、miR-365 mimic及miR-NC mimic轉(zhuǎn)染，通過MTT及Transwell法觀察轉(zhuǎn)染后胰腺癌細胞AsPC-1增殖及侵襲改變。結(jié)果顯示，相對于miR-NC mimic組，miR-365mimic組胰腺癌AsPC-1細胞增殖及侵襲受到顯著抑制（P＜0.05，P＜0.05）。通過信息生物學軟件分析及熒光素酶報告基因預測并驗證了，F(xiàn)AM230A是miR-365下游靶基因，Western

12、 Blotting實驗結(jié)果顯示，相對于miR-NC mimic組，miR-365mimic組胰腺癌AsPC-1細胞FAM230A蛋白表達水平顯著被抑制。
　　結(jié)論：
　　1，胰腺癌患者癌組織及血清中miR-365表達水平顯著低于正常癌旁組織及健康體檢者，miR-365在胰腺癌細胞系中呈現(xiàn)下調(diào)模式，在細胞水平驗證了miR-365在胰腺癌中低表達。
　　2，胰腺癌患者癌組織及血清中miR-365表達水平與胰腺癌患者遠端轉(zhuǎn)移

13、、臨床分期密切相關。血清miR-365可對胰腺癌患者與健康人進行診斷區(qū)分，具有較高的特異性與敏感度;同時，血清miR-365可作為預測胰腺癌患者總體生存的一個獨立預后因子。
　　3，胰腺癌細胞系過表達miR-365后，可顯著抑制胰腺癌細胞增殖及侵襲。此外，生物信息學及熒光素酶基因報告分別預測與證實了，F(xiàn)AM230A是胰腺癌中miR-365的下游靶基因;過表達miR-365可顯著抑制FAM230A蛋白表達，提示miR-365可能通過