內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白IRE1α在胰島β細胞中的功能與調(diào)控機制的研究.pdf

1、在真核細胞中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)折疊需求的增加會引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，誘導(dǎo)未折疊蛋白質(zhì)應(yīng)答(unfoldedproteinresponse，UPR)。三個內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白，即肌醇必需酶1(IRE1)，PKR樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK)以及活化轉(zhuǎn)錄因子6(ATF6)，分別介導(dǎo)未折疊蛋白質(zhì)應(yīng)答的三條經(jīng)典信號通路，并協(xié)同適應(yīng)性應(yīng)答去解決內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下未折疊蛋白應(yīng)答對調(diào)控細胞存活具有很重要的作用。在非常嚴(yán)重的應(yīng)激下，UPR無法修復(fù)細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，細胞將

2、會凋亡。UPR通路與糖脂代謝有密切關(guān)系，慢性的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激被認為與很多代謝疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。
　　IRE1α是最保守的一個內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激感應(yīng)器，它在胞漿端具有Ser/Thr激酶活性以及內(nèi)切酶活性。當(dāng)感應(yīng)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時，IRE1α?xí)ㄟ^多聚體化實現(xiàn)相互磷酸化得到激活。在哺乳動物中，IRE1α的RNA酶活性會使得下游轉(zhuǎn)錄因子XBP1(Xboxbindgingprotein1)的26個核苷酸切除，這種非常規(guī)的剪切會產(chǎn)生一個有活性的XBP1形

3、式，它能驅(qū)動很多未折疊蛋白應(yīng)答相關(guān)的基因表達。此外，IRE1α在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激或XBP1缺乏導(dǎo)致IRE1過度激活時可以誘導(dǎo)一批mRNA的降解，IRE1α也被發(fā)現(xiàn)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時剪切一些microRNA用來調(diào)控凋亡。
　　糖尿病是一種慢發(fā)多因素造成的復(fù)雜性疾病，主要是由于遺傳及環(huán)境因素共同造成的，其確切的發(fā)病機制目前還不清楚。對于人類來說糖尿病是一種非常古老的疾病，大約在3000年前古埃及文獻中就有提及。糖尿病是非常常見的疾病，到2010

4、年世界范圍內(nèi)有超過2億人患糖尿病，預(yù)計到2025年在世界范圍內(nèi)大概會超過3億人，在中國大概有9200萬人患有糖尿病，其中有60.7％的人沒有被診斷。糖尿病是一種代謝紊亂性疾病，它可能源于胰島素分泌缺陷，外周胰島素敏感性，或由兩者共同引起。胰島素缺乏會引起長期的高血糖進而打亂了體內(nèi)正常的糖類、脂肪和蛋白質(zhì)的代謝。糖尿病可以分為不同的類型，主要是1型和2型糖尿病。根據(jù)病理學(xué)基礎(chǔ)，1型糖尿病病人胰島素分泌很少或不足，必須采取胰島素來治療才能存

5、活;2型糖尿病是一種慢性的代謝紊性亂疾病，在世界范圍內(nèi)2型糖尿病的發(fā)病率逐漸增加。
　　內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)的打破會引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，這會導(dǎo)致胰腺β細胞功能紊亂以及糖尿病的形成，但是IRE1α在胰島β細胞中的具體功能以及調(diào)控機制尚未明確。因此，進一步深入探討IRE1α在胰島β細胞中的調(diào)控作用、分子機制及其與糖尿病的關(guān)聯(lián)對于臨床預(yù)防和控制糖尿病意義重大。
　　實驗工作分以下三部分開展:
　　第一部分胰島β細胞IRE1α敲除小鼠的建立

6、以及與1型糖尿病的關(guān)系
　　研究目的:構(gòu)建胰島β細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白IRE1α特異性敲除小鼠，初步探索IRE1α在胰島β細胞中的功能。
　　研究內(nèi)容:
　　1、利用RIPcre-flox（RIPcre，含有insulin的啟動子序列）策略來構(gòu)建組織（細胞）特異性基因敲除小鼠，即通過雙雜合子小鼠Irelf/+∶Cre與Ire1f/+小鼠交配得到β細胞特異性敲除IRE1α小鼠Ire1f/f∶Cre，對照小鼠Ire1f/f以及Cr

7、e。通過提取小鼠尾部基因組DNA來鑒定基因型;提取小鼠的胰島蛋白，來鑒定IRE1α是否被特異性敲除。在小鼠生長的過程中，監(jiān)控小鼠的體重，小鼠饑餓6小時后的血糖水平、胰島素水平，以及小鼠的攝食量。
　　2、葡萄糖耐受試驗:小鼠10周齡時，基因敲除和對照組小鼠饑餓16小時后，腹腔注射葡萄糖（0.1g/kg體重），用血糖試紙檢測注射葡萄糖前和注射葡萄糖后15、30、60、90及120分鐘的血糖值，觀察基因敲除對小鼠葡萄糖的耐受能力（GT

8、T，glucosetolerancetest）是否有影響。
　　3、胰島素耐受試驗:小鼠11周齡時，基因敲除和對照小鼠饑餓6小時后，腹腔注射胰島素（0.75U/kg體重），用血糖試紙來檢測注射胰島素前和注射胰島素后15、30、60、90及120分鐘的血糖值，觀察基因敲除小鼠對胰島素的耐受能力(ITT，insulintolerancetest)是否改變。
　　4、取10周齡的小鼠，斷頸處死后，提取小鼠的胰島，將不同基因型小鼠的

9、胰島放于12孔板中，觀察體外胰島在高糖刺激下的胰島素分泌(GSIS，glucosestimulatedinsulinsecretion)并檢測胰島內(nèi)胰島素含量。
　　5、提取10周齡小鼠的胰島，并提取胰島RNA，反轉(zhuǎn)錄之后，利用qPCR的方法來檢測細胞增殖相關(guān)基因的表達。
　　6、10周齡的小鼠，斷頸處死后，取胰腺組織并制作胰腺石蠟切片，通過HE染色觀察胰島的形態(tài)和大小是否有改變;通過insulin，glucagon和glu

10、t2（β細胞葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白2）等抗體的免疫熒光觀察胰島β細胞的比例和β細胞的功能:通過Ki67和insulin共染觀察胰島細胞的增殖。
　　研究結(jié)果:
　　1、通過westernblot檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組小鼠相比，基因敲除小鼠胰島中IRE1α蛋白明顯降低，肝臟中IRE1α蛋白沒有變化。與對照組小鼠相比，基因敲除小鼠體重、攝食量都沒有明顯的變化，但是基因敲除小鼠饑餓后血糖要明顯的高于對照組小鼠（雌性小鼠和雄性小鼠的表型是一致的

11、），饑餓胰島素水平下降。
　　2、通過葡萄糖耐受實驗(GTT)和胰島素耐受實驗(ITT)發(fā)現(xiàn)，基因敲除小鼠的葡萄糖耐受下降，但是對于胰島素的耐受和對照組相比沒有明顯的不同。
　　3、體外培養(yǎng)原代小鼠胰島細胞，然后通過低糖處理和高糖刺激，檢測細胞培養(yǎng)基中胰島素含量，發(fā)現(xiàn)基因敲除的小鼠胰島素分泌明顯的低于對照小鼠（Ire1f/f小鼠），胰島內(nèi)的胰島素含量也比對照明顯的減少。
　　4、通過HE染色發(fā)現(xiàn)，基因敲除小鼠和對照小鼠

12、的胰島在形態(tài)和大小上沒有很明顯的差異，Ki67免疫熒光結(jié)果也顯示兩組小鼠的胰島增殖沒有明顯的不同，β細胞在胰島中的比例也沒有變化，glut2熒光結(jié)果也顯示β細胞對葡萄糖的響應(yīng)沒有變化。
　　5、通過qPCR結(jié)果得出，在IRE1α敲除后，下游基因XBP1的剪切也被抑制，但是與細胞增殖相關(guān)的基因表達沒有改變。
　　研究結(jié)論:
　　1、胰島β細胞敲除IRE1α后，會引起小鼠血糖升高，血液胰島素水平下降，對葡萄糖不耐受而外周組

13、織對胰島素敏感性不變的1型糖尿病癥狀。
　　2、從HE染色以及免疫熒光結(jié)果看，在正常喂食情況下，IRE1α敲除小鼠在胰島形態(tài)大小以及增殖上沒有發(fā)生改變，但是體外培養(yǎng)的胰島中胰島素含量降低，而且高糖刺激的胰島素分泌也明顯減少，證明1型糖尿病的癥狀可能是因為胰島素合成以及胰島素分泌減少引起的。
　　第二部分在高脂飲食刺激下內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白IRE1α在胰島β細胞中的作用研究
　　研究目的:通過高脂飼料(60％fat)喂養(yǎng)野生型C5

14、7小鼠，探索高脂誘導(dǎo)的肥胖是否能引起胰島中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激;用同樣的高脂飼料喂養(yǎng)基因敲除小鼠和對照組小鼠，探索IRE1α在胰島β細胞中的功能與作用。
　　研究內(nèi)容:
　　1、8周齡野生型C57小鼠分別給予高脂飲食(60％fat)或低脂飲食(10％fat)，每周監(jiān)控小鼠體重。在給予高脂飲食或低脂飲食第8周，腹腔注射葡萄糖，檢測葡萄糖耐受性;第10周時，處死小鼠，提取小鼠胰島，并提取胰島中的蛋白及RNA，通過WesternBlot檢

15、測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的變化，qPCR檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的基因表達以及肥胖引起的增殖相關(guān)的基因表達。
　　2、12周齡的基因敲除和對照小鼠，由正常飼料喂食轉(zhuǎn)為高脂飼料(60％fat)喂養(yǎng)，持續(xù)12周，每周監(jiān)測體重以及攝食量的變化，并檢測饑餓血糖和胰島素的含量。
　　3、基因敲除和對照組小鼠經(jīng)高脂飼養(yǎng)第9周時，腹腔注射胰島素，檢測外周組織對胰島素的敏感性，在第10周時，腹腔注射葡萄糖，檢測小鼠對葡萄糖的耐受能力。
　　4、

16、基因敲除和對照組小鼠經(jīng)高脂飼養(yǎng)12周后，處死小鼠。每組小鼠中一部分小鼠用來取胰腺組織并制作胰腺石蠟切片，HE染色來觀察胰島的形態(tài)、數(shù)量和大小;insulin、glucagon和glut2等免疫熒光觀察胰島β細胞的比例和β細胞的功能;Ki67和insulin共染觀察胰島細胞的增殖;TUNEL染色來檢測胰島細胞的凋亡。另一部分小鼠提取胰島，然后提取胰島RNA，反轉(zhuǎn)錄之后，利用qPCR的方法來檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因和細胞增殖相關(guān)基因的表達。<

17、br>　　研究結(jié)果:
　　1、高脂飲食的野生型小鼠肥胖的同時，體重增加，伴隨著葡萄糖不耐受，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因的表達升高，胰島增殖相關(guān)的基因表達上調(diào)。
　　2、高脂飲食的IRE1α敲除小鼠與對照組小鼠相比，饑餓血糖進一步的升高，胰島素含量降低得更加明顯，體重與攝食量卻沒有明顯的改變。
　　3、通過HE染色發(fā)現(xiàn)，IRE1α敲除小鼠的胰島在高脂飲食下的大小和數(shù)量比對照組要明顯降低，而且Ki67染色發(fā)現(xiàn)敲除小鼠的胰島細胞增

18、殖減少，但是β細胞在胰島中的比例沒有明顯改變，而且glut2染色也沒有明顯變化，TUNEL結(jié)果顯示高脂飲食沒有導(dǎo)致胰島細胞發(fā)生明顯的凋亡。
　　4、通過qPCR檢測發(fā)現(xiàn)IRE1α敲除后，XBP1剪切水平下降，增殖相關(guān)的基因表達水平也減少。
　　研究結(jié)論:
　　1、高脂飲食引起的肥胖可以引起胰島β細胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激，同時誘導(dǎo)增殖相關(guān)基因的表達。
　　2、高脂飲食下，IRE1α敲除小鼠糖尿病癥狀加重，血糖進一步升高，

19、同時胰島增殖能力下降，這提示IRE1α在高脂誘導(dǎo)的胰島增殖中具重要作用。
　　3、從qPCR和Ki67免疫熒光結(jié)果更進一步的證明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激感應(yīng)蛋白IRE1α在高脂誘導(dǎo)的胰島增殖中起一定的作用非常重要。
　　第三部分IRE1α下游基因XBP1在胰島β細胞增殖中的調(diào)控機制研究
　　研究目的:在大鼠胰島細胞系INS-1中探索IRE1α下游基因XBP1與細胞增殖的關(guān)系，以及尋找XBP1下游靶基因及其調(diào)控機制;同時在體外基因敲除

20、小鼠的胰島細胞中過表達XBP1基因，觀察能否找到類似的靶基因的表達。
　　研究內(nèi)容:
　　1、INS-1細胞分別感染腺病毒Ad-XBP1s及對照腺病毒Ad-EGFP，48小時后，收集細胞，分別提取蛋白和RNA。Western檢測XBP1s過表達效率，檢測細胞增殖相關(guān)基因CyclinD1/D2的表達情況，qPCR檢測Ccnd1/d2/a1、Cdk4以及XBP1s下游基因Erdj4的表達。
　　2、將INS-1細胞種于內(nèi)置

21、蓋玻片的12孔板中（為得到爬片），在感染Ad-XBP1s及對照Ad-EGFP病毒兩天后，用4％多聚甲醛固定細胞，然后5％的BSA封閉細胞，在Ki67抗體處理后，用熒光二抗，核染料DAPI處理細胞，用激光共聚焦顯微鏡觀察細胞增殖;同樣在INS-1細胞感染病毒48小時之后，BrdU處理細胞3小時，4％多聚甲醛固定后，用2N的HCl來處理細胞，之后用BrdU的抗體來做免疫染色，用激光共聚焦來觀察細胞增殖的情況。
　　3、準(zhǔn)備INS-1細

22、胞，感染腺病毒Ad-shlRE1α，或同時用Ad-XBP1s來感染細胞72小時之后，收集細胞，Trizol裂解細胞提取RNA，qPCR檢測Ccnd1/d2，以及XBP1s下游基因Erdj4的表達，同時WesternBlot檢測IRE1α沉默效率，以及XBP1s過表達的效率。
　　4、構(gòu)建CylinD1-luciferase報告基因，通過軟件預(yù)測CylinD1啟動子上可能的XBP1s的結(jié)合位點，利用293T細胞共轉(zhuǎn)XBP1s，Cyc

23、linD1報告基因以及內(nèi)控質(zhì)粒Renilla，通過promega的luciferase檢測試劑盒來檢測熒光數(shù)值。
　　5、從基因敲除小鼠中提取胰島，然后感染腺病毒Ad-XBP1s或者Ad-EGFP48小時后，提取RNA，qPCR檢測XBP1s下游基因表達，同時檢測增殖相關(guān)基因的表達。
　　研究結(jié)果:
　　1、INS-1細胞過表達XBP1s后，Western結(jié)果顯示XBP1s蛋白明顯的過表達，而且CylclinD1表達上

24、升，但是CyclinD2表達沒有變化;Q-PCR結(jié)果同樣顯示Ccnd1基因表達上調(diào)。
　　2、通過沉默INS-1細胞中IRE1α后，細胞中的CyclinD1蛋白表達下調(diào)，同時CyclinD1mRNA水平上同樣減少，但是過表達XBP1s之后，CyclinD1蛋白和mRNA水平上均得到恢復(fù)。
　　3、Luciferase報告基因結(jié)果顯示，XBP1s在能夠與Ccnd1啟動子結(jié)合，同時通過點突變的方式得到“ACGT”是XBP1s在C

25、cnd1啟動子上的結(jié)合位點。
　　4、Ki67和BrdU免疫熒光實驗得出，XBP1s過表達的細胞增殖水平要明顯高于對照細胞。
　　5、IRE1α敲除小鼠胰島通過過表達XBP1s，qPCR結(jié)果顯示Ccnd1mRNA水平很明顯的上調(diào)，但是Ccnd2/a1和Cdk4等增殖相關(guān)的基因表達沒有受到影響。
　　研究結(jié)論:
　　1、在大鼠細胞系INS-1中發(fā)現(xiàn)，IRE1α下游基因XBP1s可以誘導(dǎo)cyclinD1蛋白和mRNA