內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白調(diào)控心肌細胞MMPs的研究.pdf

1、背景：
　　內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)是一種因缺血、缺氧等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)理化環(huán)境改變和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)過負(fù)荷等因素觸發(fā)的高度保守的細胞應(yīng)激性反應(yīng)。適度的ERS可通過未折疊蛋白反應(yīng)(Unfolded-Protein Response,UPR)機制恢復(fù)細胞自穩(wěn)態(tài)和修復(fù)損傷。但持續(xù)或過度的ERS通過激活ER相關(guān)凋亡途徑誘導(dǎo)細胞損傷和凋亡。鈣網(wǎng)蛋白(calreticulin,CRT)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)主要的鈣結(jié)合蛋

2、白,具有分子伴侶、調(diào)控細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)、蛋白質(zhì)合成和修飾等多種功能,參與生物體內(nèi)多種生理和病理過程。細胞發(fā)生ERS時,CRT表達升高,可作為ERS標(biāo)志性分子之一。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)CRT影響基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix Metalloproteinases,MMPs)mRNA表達及酶的活性。近年來多項研究表明ERS在心肌缺血再灌注損傷、急性心肌梗死、冠心病不穩(wěn)定斑塊的形成以及心力衰竭的發(fā)生、發(fā)展等多種心血管疾病中起著重要的作用。ERS導(dǎo)致

3、的相關(guān)細胞凋亡所參與的心肌細胞丟失,是影響缺血性心肌病心室重構(gòu)的重要因素,但關(guān)于ERS能否影響細胞外基質(zhì)成份的調(diào)節(jié)從而參與心室重構(gòu),尚需進一步深入研究。
　　目的：
　　本實驗第一部分?jǐn)M用H2O2處理H9C2心肌細胞,誘導(dǎo)ERS,進一步研究MMP-2和MMP-9活性的變化。第二部分利用了鈣網(wǎng)蛋白基因敲除小鼠胚胎成纖維細胞(crt-/-)和野生型小鼠胚胎成纖維細胞(wt)為研究對象,探討CRT基因的缺失對JNK活性的影響及JN

4、K與p53的關(guān)系,以進一步揭示ERS相關(guān)性蛋白CRT調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)成份的分子機制。
　　方法：
　　1.不同濃度的H2O2處理H9C2心肌細胞,MTT法檢測其對細胞活性的影響,檢測CRT、GRP78兩種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性相關(guān)蛋白的表達,并收集培養(yǎng)基用明膠酶譜法檢測MMP-2、MMP-9的酶活性。
　　2.體外培養(yǎng)wt和crt-/-小鼠胚胎成纖維細胞,提取總蛋白,用JNK特異性抗體從總蛋白中親和分離出JNK蛋白,加入ATP和J

5、NK特異性底物c-Jun進行細胞外磷酸化反應(yīng)。用Western blot檢測反應(yīng)產(chǎn)物中c-Jun的磷酸化水平,以此來反映細胞內(nèi)JNK的活性。
　　3.在wt細胞及crt-/-細胞加入不同濃度JNK抑制劑SP600125(0,20,30umol/l)處理24h,檢測p53蛋白的表達;并用不同濃度p53抑制劑PFT-α(0,50,80umol/l)作用wt細胞及crt-/-細胞24h,檢測JNK蛋白的表達。
　　結(jié)果：
　

6、　1.MTT結(jié)果顯示H9C2心肌細胞在H2O2(0～700umol/l)作用2h,其細胞活性與對照組相比未見明顯變化。當(dāng)H2O2濃度高達1000umol/l時對H9C2細胞活性有顯著抑制作用(p<0.05)。
　　2.與對照組相比,不同濃度H2O2處理H9C2心肌細胞2h并未引起CRT表達的改變。H2O2處理H9C2心肌細胞4h引起CRT表達增高,p<0.05,并且使其MMP-2活性升高,MMP-9活性下降,但未引起GRP78的改

7、變。
　　3.細胞外測定JNK活性提示wt細胞株c-Jun的磷酸化水平與crt-/-細胞株比較無明顯差別。
　　4.給予不同濃度JNK抑制劑,無論是wt細胞還是crt-/-細胞,各處理組的p53均無明顯變化;給予不同濃度p53抑制劑后,在wt株細胞中,JNK表達明顯降低(p<0.05),并呈劑量依賴性。然而即使是在PFT-α80umol/l大劑量濃度作用下,wt細胞中JNK表達仍明顯高于crt-/-細胞中JNK蛋白含量(p<

8、0.05)。而各濃度組PFT-α對crt-/-細胞中的JNK表達無影響。
　　結(jié)論：
　　1.H2O2處理4小時,能引起ERS,但可能由于作用時間和濃度不夠,導(dǎo)致ERS其他相關(guān)蛋白GRP78未檢測到明顯變化;并且H2O2處理4小時,H9C2心肌細胞MMP-2、MMP-9的活性發(fā)生了改變,但需要通過調(diào)整H2O2的作用時間和劑量來進一步確認(rèn)。
　　2.在wt和crt-/-細胞中,JNK活性沒有明顯差異。
　　3.在w