內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白MANF在脾臟中的表達(dá).pdf

1、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ER stress)是真核細(xì)胞的一種保護(hù)性應(yīng)激反應(yīng),通過激活未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response,UPR)通路來減少細(xì)胞內(nèi)蛋白的異常聚集,從而起到細(xì)胞保護(hù)作用。ER應(yīng)激與很多因素所致疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。越來越多的證據(jù)表明,ER應(yīng)激及其UPR通路可能參與機(jī)體的炎癥免疫反應(yīng)。脾臟是機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫中心,參與先天免疫和獲得性免疫。脾

2、臟能夠清除循環(huán)中的衰老紅細(xì)胞,并能有效去除血源性細(xì)菌和細(xì)胞殘片;加之它的T、B淋巴細(xì)胞的高度有序分布,使得脾臟成為抗菌最重要的器官。MANF(mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor,MANF)基因是從30000個基因中篩選出的對ER應(yīng)激最敏感的基因,它是一種分泌性蛋白,ER應(yīng)激能誘導(dǎo)其表達(dá)上調(diào)。故推測,MANF可能選擇性表達(dá)于脾細(xì)胞中,在脾臟的發(fā)育和漿細(xì)胞分化中發(fā)揮重要的作

3、用。
　　目的:
　　本研究的目的是觀察大鼠出生后不同發(fā)育階段脾臟的結(jié)構(gòu)變化、漿細(xì)胞的發(fā)育與分化以及MANF蛋白在脾細(xì)胞中選擇性的表達(dá)情況,為研究MANF的生物學(xué)活性與免疫調(diào)節(jié)的關(guān)系提供實驗基礎(chǔ)。
　　方法:
　　選取不同發(fā)育時期鼠的脾臟,并制備組織標(biāo)本。分別采用HE染色、免疫組織化學(xué)及免疫熒光技術(shù),觀察大鼠不同時期脾臟的結(jié)構(gòu)及CD138(漿細(xì)胞)、CD68(巨噬細(xì)胞)陽性細(xì)胞的發(fā)育特點(diǎn)以及出生后不同時期MANF

4、在脾臟中的表達(dá)情況;使用T、B淋巴細(xì)胞的表面標(biāo)記物CD3及CD20,觀察MANF在成年鼠及外傷切除的人脾臟中各類淋巴細(xì)胞中差異性的表達(dá)特點(diǎn)。用弗氏完全佐劑(Freund's complete adjuvant,FCA)制備大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎(adjuvant arthritis,AA)模型,觀察MANF在炎性大鼠脾臟中的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1.大鼠出生后不同時期脾臟的發(fā)育
　　1.1脾臟結(jié)構(gòu)的發(fā)育
　　大鼠

5、在出生后1~4 wk,脾臟的白髓和紅髓發(fā)育不成熟,沒有完整的白髓結(jié)構(gòu)和血管結(jié)構(gòu),而出現(xiàn)大量的細(xì)胞團(tuán);6 wk時白髓有雛形,脾臟的白髓和紅髓中出現(xiàn)血管樣結(jié)構(gòu);8 wk時白髓具有典型的結(jié)構(gòu)特征,如中央動脈周圍有大量的T細(xì)胞形成的PALS及B細(xì)胞組成的濾泡。
　　1.2CD68陽性細(xì)胞的發(fā)育
　　大鼠出生后1 wk,脾臟組織中即有大量的、散在分布的、呈分枝狀的CD68陽性的細(xì)胞;而在出生6 wk后,巨噬細(xì)胞呈圓形或阿米巴狀,細(xì)胞內(nèi)

6、CD68的表達(dá)量在12-22 wk時明顯增加。
　　1.3CD138陽性細(xì)胞的發(fā)育
　　大鼠在出生后1~4 wk,脾臟組織中無CD138陽性的漿細(xì)胞;6 wk后,脾臟的白髓和紅髓中少量的CD138陽性細(xì)胞;8 wk時白髓中有大量的CD138陽性細(xì)胞,此時CD138的表達(dá)量達(dá)到峰值,而后隨著月齡的增加CD138的表達(dá)有緩慢下降趨勢。
　　1.4MANF的表達(dá)
　　大鼠在出生后1~4wk,MANF在脾臟中廣泛表達(dá),尤

7、其是在成團(tuán)細(xì)胞的中MANF也有表達(dá);6~12wk后,MANF在散在的細(xì)胞中表達(dá),且定位于胞漿。這些MANF陽性細(xì)胞多數(shù)分布在邊緣區(qū)和紅髓中;少數(shù)分布在動脈周圍淋巴鞘中。而22wk后,MANF則彌散分布于胞漿中。
　　免疫熒光雙標(biāo)發(fā)現(xiàn),1-3 wk時MANF不在CD68陽性細(xì)胞中表達(dá)。在出生后4 wk時在少量的CD68細(xì)胞中有MANF表達(dá),此后表達(dá)MANF的CD68細(xì)胞逐漸增多。由于CD138陽性細(xì)胞在出生后6 wk時才出現(xiàn),此時部

8、分CD138陽性細(xì)胞中有MANF表達(dá);8 wk后CD138陽性細(xì)胞與MANF共染細(xì)胞開始逐步增加,至10 wk達(dá)到峰值,而后隨著年齡的增加MANF+CD138+數(shù)量有緩慢下降。
　　2.MANF在成熟脾臟中的選擇性表達(dá)
　　在成熟大鼠和人的脾臟中,MANF陽性細(xì)胞主要出現(xiàn)在紅髓和邊緣區(qū),不存在于白髓中,且MANF的表達(dá)主要定位于胞漿中,而不是細(xì)胞核中。MANF陽性細(xì)胞的分布與CD138和CD68陽性細(xì)胞的分布一致,該結(jié)果提示

9、MANF在成熟脾細(xì)胞中可能在漿細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中表達(dá)。為了證實該結(jié)果,我們進(jìn)一步進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),MANF不在CD20陽性的淋巴細(xì)胞中表達(dá),只有極少數(shù)的CD3陽性細(xì)胞中有MANF的表達(dá),而MANF主要在CD68和CD138陽性細(xì)胞中表達(dá)。該結(jié)果提示MANF的表達(dá)可能與ER應(yīng)激有關(guān)。
　　3.UPR通路蛋白在MANF陽性細(xì)胞中的表達(dá)
　　在成年人的脾細(xì)胞中,大多數(shù)表達(dá)BIP、CHOP、ATF6和 XBP1的細(xì)胞中有MA

10、NF表達(dá),而僅有少數(shù)BIP、CHOP、ATF6或XBP1陽性細(xì)胞不表達(dá)MANF;在CD68陽性的細(xì)胞中有BIP和CHOP表達(dá),但無XBP1的表達(dá);在CD138陽性細(xì)胞中有BIP和XBP1的表達(dá),而無CHOP的表達(dá)。上述結(jié)果提示,CD138陽性的漿細(xì)胞中存在ER應(yīng)激,MANF的表達(dá)可能與ER應(yīng)激有關(guān)。
　　4.MANF在AA大鼠脾臟中表達(dá)
　　在AA大鼠,免疫系統(tǒng)被激活,脾臟中的淋巴細(xì)胞相應(yīng)也被激活。研究發(fā)現(xiàn),在AA大鼠的脾臟

11、中,MANF的表達(dá)量明顯增多,并集中在脾臟邊緣區(qū),提示炎癥也誘導(dǎo)MANF在脾細(xì)胞中的表達(dá)。
　　結(jié)論：(1)脾臟中漿細(xì)胞的分化滯后于巨噬細(xì)胞,出生早期機(jī)體主要以非特異性免疫為主。(2)MANF在脾細(xì)胞中選擇性表達(dá),其主要在漿細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中表達(dá),這可能與這些細(xì)胞的分化和功能有關(guān)。(3)漿細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中均存在ER應(yīng)激,而漿細(xì)胞中UPR通路被激活,MANF的表達(dá)與ER應(yīng)激有關(guān);(4)免疫性關(guān)節(jié)炎癥大鼠脾臟中MANF表達(dá)上調(diào),提示炎癥