武昌羅索線蟲轉(zhuǎn)錄組測序及性別分化相關(guān)基因的功能分析.pdf

1、蚊類害蟲不僅刺吸人血，更是多種疾病的傳播媒介，對(duì)人類生產(chǎn)生活造成了極大危害。武昌羅索線蟲（Romanomermis wuchangensis）寄生前期幼蟲可侵染包括庫蚊、伊蚊在內(nèi)的多種蚊類孑孓，通過吸取宿主血淋巴內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)來完成自身生長發(fā)育過程，最終從宿主體內(nèi)脫出并造成宿主因血淋巴外流而死亡，是一種具有極大生物防治潛力的線蟲資源。武昌羅索線蟲具有特殊的性別分化機(jī)制:當(dāng)每宿主體內(nèi)寄生的線蟲數(shù)目較少時(shí)，每條線蟲相應(yīng)獲得的營養(yǎng)物質(zhì)較多，則線

2、蟲更趨于發(fā)育成為雌蟲;而當(dāng)每宿主體內(nèi)寄生的線蟲數(shù)目較多時(shí)，每條線蟲相應(yīng)獲得的營養(yǎng)物質(zhì)較少，則線蟲更趨于發(fā)育成為雄蟲。然而在自然界中，武昌羅索線蟲這一具有巨大生物防治潛力的線蟲資源數(shù)量和分布范圍有限，且對(duì)其進(jìn)行體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)該線蟲的性別分化過程在體外條件下難以完成，表現(xiàn)為性別相關(guān)表征發(fā)育不成熟，很大程度上限制了該線蟲資源的商品化生產(chǎn)并投入對(duì)蚊類害蟲的實(shí)際防治應(yīng)用中。目前，對(duì)于武昌羅索線蟲這一生物防治材料的性別分化機(jī)制的研究相對(duì)較少，故深入研

3、究其性別分化相關(guān)基因，不僅可為揭示該線蟲的營養(yǎng)決定性別分化的分子機(jī)制提供科學(xué)數(shù)據(jù)，同時(shí)還能促進(jìn)該線蟲的大量體外培養(yǎng)研究。
　　本研究通過對(duì)武昌羅索線蟲進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，篩選得到了Rwucmab-3、Rwuclaf-1和Rwuctra-2等三個(gè)武昌羅索線蟲的性別分化相關(guān)基因，并對(duì)這三個(gè)基因的表達(dá)模式和實(shí)際功能進(jìn)行了初步的探究。通過對(duì)武昌羅索線蟲寄生期3、4、5天，寄生后期1、3、5、7天和成蟲期雌雄線蟲以及懷卵雌蟲體內(nèi)的Rwucmab

4、-3、Rwuclaf-1和Rwuctra-2三個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)水平進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn):(1)Rwucmab-3基因的相對(duì)表達(dá)量在寄生期3天雌雄線蟲之間已出現(xiàn)顯著性差異(p＜0.05)，早于Rwuclaf-1和Rwuctra-2基因，推測武昌羅索線蟲性別分化過程在寄生期3天已經(jīng)啟動(dòng);(2)寄生后期1天線蟲的Rwuclaf-1基因的相對(duì)表達(dá)量顯著高于其他發(fā)育時(shí)期雌雄線蟲，根據(jù)秀麗線蟲中關(guān)于laf-1基因的研究和武昌羅索線蟲寄生后期線蟲的發(fā)育特點(diǎn)，

5、推測Rwuclaf-1基因在此時(shí)期的高表達(dá)與線蟲的性腺及雌配子的發(fā)育成熟相關(guān);(3)寄生后期1天雌線蟲體內(nèi)Rwuctra-2基因的相對(duì)表達(dá)量顯著高于其它發(fā)育期雌線蟲，根據(jù)秀麗線蟲中關(guān)于tra-2基因的研究和武昌羅索線蟲寄生后期線蟲的發(fā)育特點(diǎn)，推測可能與雌線蟲的性腺發(fā)育、配子形成等過程相關(guān)。
　　為了探究Rwucmab-3基因在線蟲體內(nèi)的實(shí)際表達(dá)部位，本研究對(duì)武昌羅索線蟲的Rwucmab-3基因進(jìn)行了原位雜交實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:Rw

6、ucmab-3基因在寄生后期雌線蟲尾部性腺卵母細(xì)胞中表達(dá)，推測Rwucmab-3基因與其在小鼠中的同源基因dmrt-1、果蠅中的同源基因dsx相同在卵母細(xì)胞內(nèi)卵黃蛋白的合成過程中發(fā)揮作用。為了進(jìn)一步探究Rwucmab-3、Rwuclaf-1和Rwuctra-2基因在武昌羅索線蟲性別分化過程中發(fā)揮的具體作用，我們對(duì)以上三個(gè)基因進(jìn)行了RNAi實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示:(1)Rwucmab-3 dsRNA浸泡組線蟲相較于gfp dsRNA浸泡組和空白對(duì)

7、照組其雌雄性比極顯著提高(p＜0.01)，達(dá)到0.35±0.02;(2) Rwuclaf-1 dsRNA浸泡組和Rwuctra-2dsRNA浸泡組線蟲相較于gfp dsRNA浸泡組和空白對(duì)照組其雌雄性比雖略有上升和下降，但其差異未達(dá)到顯著水平（p＞0.05），推測可能與性別分化過程中基因互作復(fù)雜以及所選取目的基因dsRNA的位置和長度不合適相關(guān)。
　　綜上所述，本研究首次對(duì)武昌羅索線蟲進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序并對(duì)測序所得數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析，為