人PIF1相互作用蛋白的鑒定及作用機(jī)制的初步分析.pdf

1、目的：OTUD5、CCNDBP1、CAP1三種蛋白與人類解螺旋酶PIF1存在潛在的相互作用關(guān)系。通過實(shí)驗(yàn)手段在細(xì)胞水平及體外驗(yàn)證三者中哪一種或哪幾種與PIF1存在相互作用關(guān)系，為進(jìn)一步揭示PIF1解螺旋酶的功能及相關(guān)調(diào)控機(jī)制提供新的接入點(diǎn)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：以pCMV-Myc質(zhì)粒為載體，分別構(gòu)建帶Myc標(biāo)簽的OTUD5、CCNDBP1、CAP1三種蛋白的真核細(xì)胞表達(dá)重組質(zhì)粒。以pCMV-Tag2b質(zhì)粒為載體，構(gòu)建帶C端Flag

2、標(biāo)簽的PIF1全長蛋白真核細(xì)胞表達(dá)重組質(zhì)粒。上述質(zhì)粒均在293細(xì)胞及HeLa細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)過表達(dá)。以pGEX-4T-1質(zhì)粒為載體，分別構(gòu)建帶GST標(biāo)簽的OTUD5、CCNDBP1、CAP1三種蛋白的原核細(xì)胞表達(dá)重組質(zhì)粒。另有實(shí)驗(yàn)室保藏的以pET-15b為載體、帶His標(biāo)簽的PIF1全長、C末端解螺旋酶模序（PIF1C）和N末端 PINT結(jié)構(gòu)域（PIF1N）原核細(xì)胞表達(dá)重組質(zhì)粒。上述質(zhì)粒均在BL21大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)誘導(dǎo)表達(dá)。在真核細(xì)胞

3、表達(dá)重組質(zhì)粒成功實(shí)現(xiàn)過表達(dá)的基礎(chǔ)上，將質(zhì)粒分為OTUD5與PIF1；CCNDBP1與PIF1；CAP1與PIF1三組，分別共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，使每組的兩種蛋白在細(xì)胞內(nèi)同時(shí)過表達(dá)，然后進(jìn)行CO-IP實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證蛋白質(zhì)間是否有相互作用關(guān)系。重復(fù)上述共轉(zhuǎn)染過表達(dá)過程，進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn)，通過直觀、可見的細(xì)胞內(nèi)蛋白共定位進(jìn)一步確定蛋白質(zhì)間的相互作用關(guān)系。在原核細(xì)胞表達(dá)重組質(zhì)粒成功實(shí)現(xiàn)誘導(dǎo)表達(dá)的基礎(chǔ)上，通過GST Pull-down實(shí)驗(yàn)在體外驗(yàn)證OTU

4、D5、CCNDBP1、CAP1三種蛋白是否與PIF1蛋白及其截短體蛋白存在直接的相互作用關(guān)系。
　　結(jié)果：⑴分別以Flag標(biāo)簽抗體和Myc標(biāo)簽抗體進(jìn)行CO-IP實(shí)驗(yàn)，經(jīng)Western blotting驗(yàn)證，OTUD5及CCNDBP1蛋白均可在預(yù)期位置獲得目的條帶，CAP1未獲得目的條帶。⑵分別以Flag標(biāo)簽抗體和Myc標(biāo)簽抗體進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn)，OTUD5及CCNDBP1蛋白與PIF1全長蛋白及N端截短體蛋白存在共定位，CAP1蛋白

5、不與PIF1蛋白及其N端截短體蛋白存在共定位。⑶OTUD5、CCNDBP1與PIF1經(jīng)GST Pull-down實(shí)驗(yàn)，可見目的條帶，而CAP1經(jīng)GST Pull-down實(shí)驗(yàn)未見目的條帶。
　　結(jié)論：CO-IP實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明OTUD5及CCNDBP1蛋白與PIF1存在相互作用。免疫熒光實(shí)驗(yàn)直觀的證明了CO-IP實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，OTUD5及CCNDBP1與PIF1存在細(xì)胞內(nèi)共定位。而GST Pull-down實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明OTUD5和CCN