紅色亞棲熱菌海藻糖合酶結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系及定向進(jìn)化的研究.pdf

1、海藻糖是一種應(yīng)用廣泛的非還原性雙糖，在醫(yī)學(xué)、化妝品行業(yè)、制藥學(xué)、食品加工業(yè)以及農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域都有十分誘人的應(yīng)用前景。而利用酶法制備海藻糖是現(xiàn)今生產(chǎn)海藻糖的主要手段。在可制備海藻糖的各種酶類中，海藻糖合酶可以利用麥芽糖為底物通過一步反應(yīng)生產(chǎn)海藻糖，整個(gè)過程簡(jiǎn)單可控，原料成本低廉，因此引起了人們?cè)絹碓蕉嗟年P(guān)注。然而目前天然的海藻糖合酶其結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系還未被人們所了解，并且存在著催化效率較低，反應(yīng)產(chǎn)生的副產(chǎn)物葡萄糖較多等問題，所以急需對(duì)該酶

2、的結(jié)構(gòu)功能進(jìn)行研究，并且建立適合于海藻糖合酶定向進(jìn)化的方法，對(duì)該酶進(jìn)行改造。
　　 我們前期已經(jīng)克隆得到來源于紅色亞棲熱菌的海藻糖合酶基因，并成功地將其在大腸桿菌中進(jìn)行異源表達(dá)。該酶具有良好的嗜熱性以及穩(wěn)定性，因此具有工業(yè)應(yīng)用潛力。但是如果將該酶直接用于工業(yè)生產(chǎn)，那么它的活性還不是很高，有進(jìn)一步提升的空間。同時(shí)對(duì)該酶的結(jié)構(gòu)、作用機(jī)理以及熱穩(wěn)定性機(jī)制也還不清楚，有必要進(jìn)行研究，為進(jìn)一步提升酶的催化效率或熱穩(wěn)定性提供理論依據(jù)。

3、>　　 在本研究中，首先構(gòu)建了紅色亞棲熱菌N端缺失突變子與C端缺失突變子兩種缺失突變蛋白。通過對(duì)二者活性及二級(jí)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，僅含C端結(jié)構(gòu)域的蛋白與全長(zhǎng)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)相似，均為α/β型，這也是α淀粉酶家族的典型結(jié)構(gòu)。缺失C端而僅含有N端結(jié)構(gòu)域的蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，說明紅色亞棲熱菌海藻糖合酶的C端區(qū)域?qū)S持蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性有重要作用。
　　 通過構(gòu)建一系列長(zhǎng)度遞減的C端片段缺失蛋白，我們發(fā)現(xiàn)C端缺失44個(gè)氨基酸后，蛋白依然具有活

4、性，而且最適反應(yīng)溫度依然保持在50℃，但在60℃保溫1h后殘余酶活低于全長(zhǎng)蛋白，說明紅色亞棲熱菌海藻糖合酶的C端能夠影響蛋白的熱穩(wěn)定性。而C端缺失44個(gè)氨基酸的截短蛋白對(duì)底物選擇性也發(fā)生了改變，它對(duì)麥芽糖的親和力更高，說明紅色亞棲熱菌海藻糖合酶C端結(jié)構(gòu)域可能對(duì)酶與底物的結(jié)合有影響。而當(dāng)C端缺失68個(gè)或者更多氨基酸殘基時(shí)，異源表達(dá)的蛋白無法正確折疊為可溶性蛋白，即使經(jīng)過蛋白質(zhì)復(fù)性后依然沒有活性，說明從C末端第68個(gè)氨基酸開始的C端片段能夠

5、影響蛋白結(jié)構(gòu)與功能。
　　 其次，構(gòu)建了紅色亞棲熱菌海藻糖合酶與嗜熱棲熱菌海藻糖合酶C端與N端互換的雜合蛋白TSTtMr與TSMrTt。通過對(duì)兩種雜合蛋白的表達(dá)純化，測(cè)定酶學(xué)動(dòng)力學(xué)常數(shù)以及溫度耐受性等酶學(xué)性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)擁有相同N端結(jié)構(gòu)域的蛋白，其酶學(xué)動(dòng)力學(xué)常數(shù)也大致相似，而且有相同的最適反應(yīng)溫度與類似的溫度耐受性，說明海藻糖合酶的N端結(jié)構(gòu)域與催化活性密切相關(guān)，同時(shí)影響酶的嗜熱性和熱穩(wěn)定性。而雜合蛋白TSTtMr與麥芽糖的親和能力較紅

6、色亞棲熱菌海藻糖合酶有所提高，而能夠反映催化效率的kcat/Km值是紅色亞棲熱菌海藻糖合酶的2倍，說明該雜合蛋白催化效率更高。
　　 第三，為了研究影響紅色亞棲熱菌海藻糖合酶活性與熱穩(wěn)定性的具體區(qū)域或位點(diǎn)，本研究對(duì)該酶的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行模擬，并對(duì)預(yù)測(cè)得到的關(guān)鍵位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變研究。通過Swiss-Model同源建模，發(fā)現(xiàn)紅色亞棲熱菌海藻糖合酶N端第3位-第543位氨基酸殘基屬于α淀粉酶家族成員，擁有類似于β/α的結(jié)構(gòu)，該模擬結(jié)構(gòu)中含

7、有一個(gè)“口袋”區(qū)域，其中含有4個(gè)α淀粉酶家族保守區(qū)及關(guān)鍵氨基酸殘基。通過定點(diǎn)突變，能夠確定位于保守區(qū)中的H104、D200以及第三保守區(qū)對(duì)海藻糖合酶的活性起至關(guān)重要的作用，當(dāng)將這些關(guān)鍵位點(diǎn)突變后，蛋白徹底失去活性。此外，位于口袋結(jié)構(gòu)中的Y135、R388、R392位點(diǎn)也影響蛋白的功能，將它們突變?yōu)楸彼岷?，蛋白發(fā)生了活性喪失或下降。R392A的突變還會(huì)影響蛋白的嗜熱性，使其在50℃失活，而在30℃具有活性，但與野生型蛋白相比，催化能力大

8、大降低。說明R392位點(diǎn)或附近相關(guān)區(qū)域能夠影響蛋白活性及嗜熱性。
　　 第四，對(duì)紅色亞棲熱菌海藻糖合酶的定向進(jìn)化進(jìn)行了研究。確立了利用甲苯透性化細(xì)胞制備粗酶，經(jīng)過DNS反應(yīng)后在570 nm處測(cè)定吸光度，以檢驗(yàn)紅色亞棲熱菌海藻糖合酶活性高低的高通量篩選方法。運(yùn)用易錯(cuò)PCR以及分段DNA改組法對(duì)紅色亞棲熱菌海藻糖合酶進(jìn)行定向進(jìn)化的初步研究，經(jīng)過一輪易錯(cuò)PCR和一輪分段DNA改組篩選得到一株粗酶活力為野生型紅色亞棲熱菌海藻糖合酶1.6