肝銅試驗診斷意義

1、楊旭教授簡介,楊旭教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師， 原中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院感染科主任、湖南省肝病學(xué)專業(yè)委員會主任委員、湖南省傳染病學(xué)專業(yè)委員會副主任委員。1981研究生畢業(yè)， 1990在美國留學(xué)3年。90年代起從事肝病的臨床、教學(xué)和科研，重點研究肝豆狀核變性，親自診治肝豆狀核變性590余例，患者來自全國各地25個省市（含香港），建立了肝銅測定、基因診斷、快速驅(qū)銅等一整套診療新方法，診斷準確率99.0%，治療有效率95%，出版肝豆狀核變性專著1

2、部，論文30余篇。 楊教授即將報告的關(guān)于肝銅研究的論文已被“Hepatology”接受，已在網(wǎng)上發(fā)表，即將在雜志上發(fā)表，這是肝銅研究領(lǐng)域具有里程碑意義的論文。,肝銅試驗診斷意義的前瞻性研究,中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院肝病研究中心楊旭 唐曉鵬 張永紅 羅開忠等,一、研究背景和目的,,研究背景,肝豆狀核變性（Wilson disease, WD）是重要的遺傳性疾病，1912年Wilson首先詳細地描述本病四十年代發(fā)現(xiàn)銅的蓄積是本病的原

3、因，1948年Cuming證實肝、腦銅含量升高1968年Smallwood 在柳葉刀雜志報告在一些肝病中的肝銅含量，證實WD肝銅顯著增高，提出診斷WD的標準是≥250μg/g干重,研究背景,但是，以后有多篇論文報告一些典型WD肝銅少于250μg/g干重2005年Ferenci等發(fā)表肝銅研究論文，包括114例WD，219例其他肝病，提出按常規(guī)標準，肝銅試驗的敏感性83.3%，最佳臨界值為≥ 75 μg/g。這一標準后來被美國和歐洲WD

4、指南引用，也被許多論文引用為什么差別這么大？原因不清楚,存在的問題,2003年我院在國內(nèi)率先建立的肝銅測定方法，檢查了許多病人。根據(jù)我們自己的臨床觀察，我們感到現(xiàn)有肝銅的診斷標準與實際不完全相符。為此，我們系統(tǒng)地復(fù)習(xí)了幾乎所有的肝銅文獻，發(fā)現(xiàn)肝銅研究存在幾個突出的問題。,存在的問題,1、盡管肝銅試驗是WD最重要的的診斷試驗，但是其方法沒有標準化。2、以前的研究表明，肝銅的分布是不均勻的。但是，一般用部分肝活檢組識測定肝銅，這種方法

5、可能因為取樣誤差而影響測定結(jié)果。3、所有肝銅研究都是回顧性，沒有前瞻性的。4、所有肝銅研究所包括的病例少，病種少，缺少大樣本、多病種研究,研究目的,建立一個簡便、可靠的肝銅測定方法（這是研究肝銅試驗的診斷意義的前題）采用前瞻性、多病種、大樣本的方法評估我們設(shè)計的肝銅測定方法的可靠性探討肝銅試驗的最佳診斷標準、敏感性、特異性、陽性和陰性預(yù)測值,二、研究方法,,研究設(shè)計,設(shè)計概要：前瞻性隊列研究時間：2007年6月—2015年5月

6、地點：中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院肝病中心納入標準：可疑WD患者、WD患者的親屬需要肝活檢者、其它各種需要進行肝活檢者。排除標準：有肝活檢禁忌者、不愿進行肝活檢者、WD患者驅(qū)銅治療超過6月、肝組織小于1mg干重,WD診斷標準,根據(jù)美國和歐洲WD指南：典型神經(jīng)癥狀、銅藍蛋白降低、K-F陽性、尿銅升高根據(jù)2003年國際WD會議提出的計分診標準： ≥4，診斷WD不典型病例、疑難病例根據(jù)長期臨床觀察結(jié)果總之，要確保WD診斷準確無誤,肝銅測定方

7、法,B超定位，每人穿刺2針，用1條完整的肝活檢組織測定肝銅將肝組織置于白紙上，迅速用針頭將肝組織卷成一小團將存有肝組織的紙片置于自制的67℃干燥箱2小時，徹底干燥用萬分之一分析天平（METTLER梅特勒E電子天平）準確稱取總重（紙+肝），用干凈的小刀片將肝組織刮下，置于1.5ml塑料瓶，再稱取紙片的重量，即可獲得肝組織的重量。,肝銅測定方法,將肝組織送專門實驗室，采用濃硝酸+過氯酸（4：1）150 ℃消化，用火焰原子吸收光譜法測定

8、銅含量。采取三大措施減少測量誤差，確保測定結(jié)果準確可靠：肝組織的處理全部由我完成專業(yè)實驗室、同一技術(shù)人員測定肝銅每批實驗都設(shè)有對照肝組織，與待測肝標本平行測定肝銅,統(tǒng)計分析,所用統(tǒng)計分析都是用SPSS軟件完成定量和定性指標分別用T試研和卡方試驗進行顯著性測定肝銅試驗的診斷意義用敏感性、特異性、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、ROC表示（受試者工作特征性曲線）。用ROC計算最佳臨界值,三、結(jié)果,,病人入組情況,總肝活檢人數(shù)：3350

9、2次肝活檢及肝銅測定人數(shù)：714排除例數(shù)：23有效例數(shù)：691總活檢例數(shù)用于肝活檢的安全性分析總有效例數(shù)用于肝銅試驗診斷意義分析,各種肝病肝銅含量,疾病種類 例數(shù) 肝銅含量（ 250μg/g干重）肝豆狀核變性 178 770.6±393.2WD雜合子 24 110.7±51.8PBC&PSC 48

10、 318.2±299.7病毒性肝炎 198 50.1±35.3AIH 50 82.1±66.0脂肪肝 40 40.4±28.1 GS&DS 28 37.3±19.7 …

11、…………………………………………..,診斷意義,WD肝銅均值顯著高于其他任何肝病除外PBC和PSC，按常用的診斷標準（≥250μg/g.干重）敏感性：94.4%特異性： 96.8%陽性預(yù)測值： 91.8%陰性預(yù)測值： 97.8%,診斷意義,亞型分析：肝型的敏感性：100%兒童型的敏感性：100%ROC顯示最佳臨解值：209μg/g.干重以209μg/g.干重為診斷標準：總敏感性：99.4%總特異性： 96.1%,影

12、響肝銅含量的因素,男女WD患者肝銅無顯著性差異肝組織炎癥和纖維化程度肝銅含量無影響兒童肝銅顯著性高于成人肝銅神經(jīng)型肝銅顯著低于其他表型,肝重對肝銅測定的影響,肝重(mg) 例數(shù) 平均肝銅 變異系數(shù)(%)1.0~1.5 22 618.4 76.01.6~2.0 46 856.3 51.02.1~2.5 40

13、 710.9 51.82.6~3.0 37 829.9 41.0≥3.1 33 800.4 39.2,肝活檢的并發(fā)癥,活檢后可出現(xiàn)短暫、局部或右肩部不適、疼痛，兩組無差異少數(shù)患者出現(xiàn)短暫低血壓、肝包膜局部血腫，兩組無差異，不需特殊處理1例并發(fā)氣胸（肝穿1次），內(nèi)科處理好轉(zhuǎn)無肝活檢引起的死亡病例,四、討論,

14、,肝銅測定的難點,有創(chuàng)檢查，有一定風(fēng)險標本微小，干重僅0.5~3.5mg肝銅分布不均勻，樣本越少，取樣誤差越大操作步驟多：活檢、干燥、稱量、消化、光譜分析等，任何一步都有可能造成測量誤差，影響測定結(jié)果測定方法未標準化,減少測量誤差的關(guān)鍵措施,1、用1條完整的肝組織而不是部分肝組織，以減少取樣誤差2、肝組織置于小片白紙上干燥、稱重，由于皮重很小，可減少稱重的誤差3、銅含量測定是在經(jīng)國家質(zhì)量驗正認可的專門實驗進行4、干燥及稱重

15、全部是我做的，銅含量測定全部由同一技術(shù)人員做的，減少操作誤差5、每次檢測設(shè)計對照，平行檢測，觀察是否存在系統(tǒng)誤差,影響肝銅測定的因素,以前認為肝纖維化，特別是肝硬化是影響測定結(jié)果的關(guān)鍵因素，往往把陰性結(jié)果歸因于肝硬化所引起的肝銅分布不均本研究證明，性別、肝臟炎癥程度、肝纖維化程度對肝銅測定并無影響肝銅含量的變異系數(shù)隨肝重增加而減少（1-1.5mg,CV:76.0%; 3.0-3.5m, CV: 39.1%)。肝組織的多小是影響測定

16、結(jié)果的關(guān)鍵因素,肝銅試驗的診斷標準,68年提出的標準：≥250μg/g.干重。僅僅根據(jù)少數(shù)WD和其他病人得到的2005年提出的標準：≥75μg/g.干重。依據(jù)：回顧性研究，用部分肝組織測定肝銅，114例WD，219例其他病人新標準： ≥209μg/g.干重。依據(jù)：前瞻性研究，用整條肝組織測定肝銅，178例WD，513例其他病人，病種多相信我們的標準更符合實際,肝銅試驗的診斷意義,舊標準(≥250μg/g.干重)敏感性：94.4%

17、特異性：96 .8% 新標準(≥209μg/g.干重)敏感性：99.4%特異性：96 .1%肝銅試驗是診斷WD最有價值的試驗,重要發(fā)現(xiàn)之一,肝銅沉積的理論：銅最早在肝臟沉積，超過其最大負荷后溢出，在頭部及其他組織沉積。按這一理論，神經(jīng)型的肝銅應(yīng)最高。一個未曾預(yù)料到的發(fā)現(xiàn)是，許多單純神經(jīng)型WD肝臟病例完全正常，其平均肝銅顯著低于其他表型，甚至低于無癥狀者這一發(fā)現(xiàn)可能具有重要的理論意義。我們提出，體內(nèi)銅的沉積不都是從肝臟開始的

18、,重要發(fā)現(xiàn)之二,從理論上來說，如果不治療，WD患者體內(nèi)的銅不斷增加，因此，高齡患者肝銅應(yīng)高于低齡患者。另一未預(yù)料的發(fā)現(xiàn)是兒童WD的平均肝銅顯著高于成人?？赡艿臋C理是：1、銅的蓄積不僅與年齡有關(guān)，更與WD突變的嚴重性有關(guān)：突變越重，銅沉積越快，發(fā)病越早。兒童患者突變一般更嚴重，所以銅更高2、WD動物模型表明，肝銅沉積在出生幾月后到高峰，數(shù)月后逐踐降低，這種現(xiàn)象可能與機體逐踐發(fā)展了不依賴于WD基因的銅平衡機制有關(guān)。,肝銅試驗的特殊意義

19、,1、是確診不典型肝型WD（銅藍蛋白正?；蜉p度降低，K-F環(huán)陰性，或尿銅正常）最可靠的依據(jù)，敏感性100%，陰性可排除WD2、是確診兒童WD最可靠的依據(jù)，敏感性100%，陰性可排除WD。我們已解決幼兒肝活檢的技術(shù)問題。3、是鑒別WD和其他原因所致神經(jīng)癥狀的最可靠的依據(jù)，有時甚至是唯一依據(jù),肝銅試驗的特殊意義,4、肝活檢加肝銅是鑒別WD和WD雜合子最可靠的依據(jù)，有時甚至是唯一依據(jù)5、是鑒別病毒性肝炎和病毒性肝炎合并WD的最可靠的依據(jù)

20、，有時甚至是唯一依據(jù)6、是鑒別WD性脂肪肝和非酒精性脂肪肝最可靠的依據(jù)，因為兩者肝銅差異極為顯著,肝銅試驗的局限性,1、有創(chuàng)試驗，有一定禁忌癥2、其它原因引起的慢性膽汁淤積也可引起肝銅升高，甚至與WD一樣高。典型PBC，PSC，家族性進行性肝內(nèi)膽汁淤積等一般不會與WD混淆不典型PBC，PSC和其它不明原因肝病引起肝銅升高，可誤診WD,隱原性肝銅升高,10年來，我們遇見10例來自全國各大醫(yī)院介紹來的病例：北京、重慶、四川、吉林、

21、廣西、江西、湖南等地患者均經(jīng)過系統(tǒng)檢查，原因不明，肝銅都很高，其中5例WD計分超過WD診斷標準。經(jīng)過長期觀察，排除WD,鑒別方法,1、K-F和尿銅：兩者都可異常，鑒別意義不大2、肝銅：兩者均可升高，無法鑒別3、 WD score ：有較大意義，但少數(shù)膽汁淤積可≥44、銅藍蛋白：意義大，膽汁淤積很少降低5、 GGT、ALP：膽汁淤積多升高，WD極少升高（兒童僅ALP升高）,診斷要點,1、對于肝銅升高的患者，必須考慮隱源性膽汁淤積

22、的可能性2、對于銅藍蛋白正?；蜉p度降低、GGT和ALP升高5倍以升的患者，診斷WD要特別慎重3、如不能排除WD，可試用驅(qū)銅治療。如治療6月~12月無明顯好轉(zhuǎn)，排除WD,五、結(jié)論,1、我們設(shè)計的肝銅測定方法是可靠的2、肝銅試驗是非常有價值的診斷方法，其最佳臨界值：≥209μg/g.干重）敏感性：99.4%，特異性： 96.1%3、肝型和兒童WD的敏感性100%，陰性可排除WD4、對于肝銅升高患者，要考慮隱源性膽汁淤積可能性,謝