光動力學療法影響變形鏈球菌生長和形態(tài)的體外研究

1、<p>　　光動力學療法影響變形鏈球菌生長和形態(tài)的體外研究</p><p>　　許小輝1，蔣 琳1，林居紅1，劉明方2（401147重慶，重慶醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院兒童牙病中心與口腔預防科1；400016重慶，重慶醫(yī)科大學實驗教學中心2）</p><p>　　[摘要] 目的 研究甲苯胺藍為光敏劑介導的光動力學療法對變形鏈球菌體外生長及表面形態(tài)的影響，探討光動力學療法影響致齲菌生長

2、代謝的作用機制。方法 在不同光劑量和不同光敏劑濃度下，通過體外活菌菌落計數(shù)法測定光動力學療法對變形鏈球菌的生長抑制作用，掃描電鏡觀察光動力學療法處理前后菌體表面形態(tài)的改變，實驗分空白對照組、光敏劑對照組、光對照組和實驗組，各組間活菌菌落取對數(shù)值后采用析因設計方差分析。結果 光動力學療法能顯著抑制變形鏈球菌的體外生長，隨著光照時間和光敏劑濃度的增加，其滅菌效果逐漸增強。當光敏劑濃度為100 μg/ml，光照時間為5、15、25 min時，

3、細菌菌落對數(shù)值分別為7.40±0.13、6.86±0.14、6.44±0.28，與空白對照組（8.30±0.04）相比差異有顯著性（P<0.01），5 min與15 min兩實驗組之間差異有顯著性（P<0.01）。光敏劑濃度和光劑量二因素之間存在交互作用（F=19.47, P<0.01）。掃描電鏡觀察結果顯示實驗組變形鏈球菌與對照組相比菌體表面粗糙不平，有水泡狀凸起。結論 甲苯胺

4、藍為光敏劑介導的光動力學療法能顯著抑制變形鏈球菌體外生長</p><p>　　[關鍵詞] 光動力學療法；變形鏈球菌；齲病</p><p>　　[中圖法分類號] R780.1 [文獻標志碼] A</p><p>　　In vitro study of Photodynamic Therapy on the Viability and Morphology of

5、 Streptococcus mutans</p><p>　　Xu Xiaohui 1, Lin Juhong1, Liu Mingfang2, Jiang Lin (1Children’s dental center, the Affiliated Stomatology Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing,401147; 2Teaching

6、 center of Chongqing Medical University, Chongqing,400015, China)</p><p>　　[Abstract] Objective To evaluate the impact of photodynamic therapy on the viability and morphology of Streptococcus mutans in a pla

7、nktonic culture. Methods Inhibitory action of toluidine blue O-mediated photodynamic therapy on Streptococcus mutans were analyzed by colony-counting method under different light intensity in vitro conditions;Cell morpho

8、logic changes of streptococcus mutans was observed under scanning electron microscope. Samples were prepared and divided into control group , photos</p><p>　　[Key words] Photodynamic therapy; Streptococcus m

9、utans; Dental caries</p><p>　　Supported by the project of Chongqing Bureau of Public Health（2008-2-243). Corresponding author:Lin Juhong, Tel:（023）89035821-8301, E-mail : juhonglin@sina.com</p><p&

10、gt;　　光動力學療法(photodynamic therapy，PDT)是一種聯(lián)合利用光、光敏劑和氧分子產(chǎn)生光化學效應選擇性殺傷病原微生物的新方法[1]，當感染部位局限時，其治療效果更具優(yōu)勢。近年來，PDT逐漸應用于口腔醫(yī)學。作為繼癌癥、心血管疾病之后的第三大慢性非傳染性疾病，齲病形成和發(fā)展的主要因素是細菌及其代謝產(chǎn)物。目前國外已有學者研究不同光敏劑介導的PDT對主要致齲菌的影響，以探索其應用于控制菌斑和預防齲病的可能性[2]；國內(nèi)關

11、于PDT在齲病防治領域的研究報道甚少。變形鏈球菌是公認的主要致齲菌之一，其在口腔中存在的數(shù)量及比例，可以作為齲患風險評估的一個重要指標。本實驗通過體外實驗研究在不同光劑量和不同光敏劑濃度下PDT對變形鏈球菌的生長抑制作用，并用掃描電鏡觀察處理前后變形鏈球菌菌體形態(tài)的改變，初步探討PDT影響致齲細菌生長代謝的機制，為其作為一種預防齲病的新方法應用于臨床提供初步理論依據(jù)。</p><p><b>　　1材料

12、與方法</b></p><p>　　1.1 實驗菌株與培養(yǎng)基</p><p>　　變形鏈球菌 Streptococcus mutans ATCC25175。實驗菌株由四川大學口腔生物醫(yī)學工程教育部重點實驗室提供。培養(yǎng)基：BHI培養(yǎng)基，由友康基業(yè)生物科技（北京）有限公司提供。</p><p><b>　　1.2光敏劑和光源</b>&l

13、t;/p><p>　　光敏劑：甲苯胺藍（toluidine blue O,TBO）粉劑（Sigma, St. Louis, MO,USA），用生理鹽水分別配制成濃度為50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml的溶液，0.22μm微孔濾器過濾除菌，4℃下避光保存，備用。光源：歐美娜窄譜紅光光動力治療儀(Photo Therapeutics Ltd，UK)，由重慶醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院提供。具體參數(shù)如下：波長（63

14、3±3）nm，輸出功率（40±5）W,功率密度為100mW/cm2，光源類型為LED二極管非相干光。</p><p><b>　　1.3 實驗方法</b></p><p>　　1.3.1 實驗菌液的制備 將變形鏈球菌ATCC25175凍干菌種復蘇，接種于BHI血瓊脂培養(yǎng)基，37℃下厭氧（80% N2，10%H2，10% CO2）培養(yǎng)48 h，

15、經(jīng)生化鑒定及形態(tài)學檢查為純培養(yǎng)物后，接種于BHI液體培養(yǎng)基增菌18 h，麥氏比濁法調(diào)整菌液濃度為1.0McFarland（3.0×108 CFU/ml），稀釋100倍后備用。</p><p>　　1.3.2 PDT的處理過程和實驗分組 取標準96孔板(Coming Incorporated)1個，每孔分別滴加100 μl甲苯胺藍溶液和100 μl菌液，使甲苯胺藍最終濃度為25、50、100 μg/

16、ml，菌液濃度為1.5×106 CFU/ml?？瞻讓φ战M分別滴加100 μl BHI培養(yǎng)基和100 μl菌液。在渦旋振蕩器上混勻后，黑暗中放置5 min，然后按產(chǎn)品說明書用LED光源在距離96板3 cm處照射，照射時間分別為5、15、25 min，相應的照射劑量為31.5、94.5、157.5 J/cm2。為了避免光照時間的相互干擾，在處理組照射時，其他各組均用錫箔紙遮蓋以隔絕光源。</p><p>　

17、　1.3.3 菌落計數(shù) PDT處理后，將96孔板置于渦旋振蕩器上震蕩1 min以充分混勻菌液，取100 μl菌液稀釋于900 μl 0.01 mol/L無菌PBS緩沖液（pH=7.0）中，吹打均勻后再取100 μl菌液稀釋于900 μl PBS緩沖液中，如此反復做10倍遞增連續(xù)稀釋，使各管中的菌液稀釋度分別為102～105 CFU/ml，取103 ～105 CFU/ml稀釋液各20 μl滴注于BHI瓊脂平板培養(yǎng)基上，37℃下厭氧（

18、80% N2、10%H2、10% CO2）培養(yǎng)24～48 h，選擇最合適的濃度段進行菌落計數(shù)。取每組3個平行樣，取均值，實驗重復3次。</p><p>　　1.3.4 掃描電鏡觀察 在無菌試管中放入大小為0.8 cm×0.8 cm無菌蓋玻片，加入5 ml BHI液體培養(yǎng)基，接種菌液100 μl,37℃兼性厭氧條件下（80% N2，10%H2，10% CO2）培養(yǎng)24 h后，涂片檢查以確保樣本無污染

19、。小心棄去菌液，取出蓋玻片，無菌PBS緩沖液輕柔漂洗2遍以去除疏松附著的游離菌，實驗組蓋玻片表面滴加25 μl濃度為100 μg/ml的甲苯胺藍，黑暗中放置5 min后光照15 min，相應的能量密度為94.5 J/cm2。對照組蓋玻片不做處理，僅用無菌PBS緩沖液輕柔漂洗2遍，將實驗組和對照組蓋玻片立即放入2.5%戊二醛溶液中，4℃下過夜，然后依次用30%、50%、70%、90%、100%乙醇梯度脫水，干燥、噴金，掃描電鏡下觀察細菌形

20、態(tài)。</p><p><b>　　1.4 統(tǒng)計學分析</b></p><p>　　用SAS9.0對實驗結果進行處理，各組間進行析因設計方差分析。</p><p><b>　　2 結果</b></p><p>　　2.1光動力學療法對變形鏈球菌體外生長的抑制作用</p><p>

21、;　　PDT對變形鏈球菌的生長抑制作用實驗結果見表1、2。單獨的光和甲苯胺藍對變形鏈球菌生長無明顯影響，與空白對照組相比差異無統(tǒng)計學意義（P﹥0.05）。二者同時作用產(chǎn)生的光動力學效應顯著抑制變形鏈球菌的生長。PDT實驗組與空白對照組相比有顯著性差異（P<0.05）。隨著光照時間和光敏劑濃度的增加，其滅菌效果逐漸增強。當光敏劑濃度≤50 μg/ml時，同一濃度段不同光照時間段各組間無顯著性差異（P﹥0.05）。當光敏劑濃度為100

22、 μg/ml時，光照時間5min與15min兩實驗組間有顯著性差異（F=7.91，P<0.01）, 15min與25min兩實驗組間無顯著性差異（F=2.67，P﹥0.05）；光敏劑濃度和光照時間二因素之間存在交互作用（F=19.47，P<0.01）。</p><p>　　表1 不同濃度甲苯胺藍和不同光照時間下光動力作用前后Sm菌落數(shù)對數(shù)值(n=3，±s）</p><p&

23、gt;　　a:P<0.05 ,與空白對照組(TB=0,光照時間=0)比較；b:P<0.01 ,與實驗組(TB=100,光照時間=5)比較</p><p>　　表2 甲苯胺藍濃度和光照時間析因設計分析結果</p><p>　　2.2 光動力學療法對變形鏈球菌形態(tài)的影響</p><p>　　掃描電鏡圖片結果顯示：實驗組變形鏈球菌形態(tài)與對照組相比有明顯變化。在

24、20 000倍掃描電鏡圖下，對照組變形鏈球菌菌體外形清晰，菌細胞表面光滑連續(xù)、無缺損（圖1A），實驗組細菌雖然菌體外形清晰，但大部分菌細胞表面粗糙不平，有水泡狀凸起，菌細胞周圍有散在的不定形物質(zhì)溢出（圖1B）。</p><p>　　↑：右下角為箭頭對應處細菌放大圖。</p><p>　　A:對照組;B：實驗組</p><p>　　圖2 掃描電鏡觀察實驗組變形鏈球菌形

25、態(tài)（×20 000）</p><p><b>　　3討論</b></p><p>　　PDT的主要原理涉及光敏劑、光源和氧分子[3]。光敏劑在適宜光的激發(fā)下由基態(tài)變成激發(fā)態(tài)并與與周圍的氧分子結合，釋放出單線態(tài)氧等多種活性氧物質(zhì)。這些活性氧物質(zhì)可以與微生物體內(nèi)的重要生物大分子如蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)發(fā)生氧化還原反應，造成生物大分子活性物質(zhì)喪失，導致微生物死亡[4,

26、5]。與傳統(tǒng)抗菌療法相比，PDT不僅對各種革蘭氏陽性菌和陰性菌都有顯著的抑制作用，而且不會產(chǎn)生細菌耐藥性[6,7]。與單純的激光治療相比， PDT屬于冷光治療，更為安全可靠。此外，光敏劑與細菌結合的能力遠遠強于與哺乳動物體內(nèi)細胞的結合能力，因此PDT表現(xiàn)出對組織表面或組織內(nèi)細菌的選擇性殺傷作用，而對正常組織細胞影響較小[8]；當感染部位局限時治療效果更具優(yōu)勢。而口腔疾病大多數(shù)是由于細菌引起的慢性局限性感染，PDT由于其治療優(yōu)勢，在口腔醫(yī)

27、學領域的應用前景被國內(nèi)外學者看好。國外已有學者[9]證實波長為632.8nm的He-Ne激光與甲苯胺藍結合產(chǎn)生的光動力學效應能夠破壞變形鏈球菌生物膜的穩(wěn)定性，提出甲苯胺藍和He-Ne激光結合產(chǎn)生的光動力學效應可以用于治療牙菌斑感染性疾病。然而國內(nèi)類似研究卻鮮有報道。</p><p>　　細菌是影響齲病形成和發(fā)展的主要因素，它們以菌斑生物膜的形式在牙表面聚集，通過生長代謝活動，改變局部微環(huán)境條件，造成牙體硬組織損傷

28、。變形鏈球菌血清型c、e、f仍然是公認的與齲病密切相關的主要致病菌，其在口腔中存在的數(shù)量以及與其他細菌的比例，可以作為齲患風險評估的一個重要指標[10]。因此本實驗選取變形鏈球菌為研究對象。</p><p>　　Zanin等[11]用甲苯胺藍與發(fā)光二級管激發(fā)光（波長為630nm）結合作用于遠緣鏈球菌和變形鏈球菌3-7天的生物膜，發(fā)現(xiàn)當甲苯胺藍濃度為0.1mg/ml，激發(fā)光能量密度為85.7 J /cm2時，產(chǎn)生的

29、光敏作用能夠減少生物膜內(nèi)95%以上的細菌數(shù)量。本實驗結果顯示：甲苯胺藍為光敏劑介導的PDT可以顯著抑制變形鏈球菌的生長，隨著光照劑量和甲苯胺藍濃度的增加其滅菌效果逐漸增強；當光敏劑濃度為100 μg/ml，光照時間為15min時，PDT的效果達到最優(yōu)狀態(tài)。這個結果與Zanin的結論非常接近，而Araujo PV[12]用甲基藍作為光敏劑觀察其被紅色激光激發(fā)后產(chǎn)生的光動力效應對變形鏈球菌的影響，在光敏劑濃度為25 mg/L時取得了最佳的抗

30、菌作用（滅菌率為75%）; Metcalf[13]用波長550nm白色激光激發(fā)光敏劑赤蘚紅作用于變形鏈球菌，發(fā)現(xiàn)5×1min的間斷照射效果優(yōu)于5min連續(xù)光照,推測原因是連續(xù)光照時光敏劑可能還未完全與細菌結合時便被光活化。本實驗結果與國外相似實驗的差異性說明PDT的成功療效依賴于適宜的光敏劑類型、劑量和照射光源類型、光劑量等具體治療參數(shù)的精確優(yōu)化。此外，</p><p>　　本實驗選擇的光敏劑甲苯胺藍是

31、第二代光敏劑，與第一代光敏劑相比，能迅速與細菌結合并穿透細胞膜進入菌細胞內(nèi)部，對病變區(qū)域、細菌有較好的選擇性[14,15]；在組織中有較好的穿透深度；與波長為630nm左右的光結合能產(chǎn)生單態(tài)氧，在殺滅致病菌的同時對正常組織細胞無明顯毒副作用[16]；Soukos[17]報道甲苯胺藍吸收適宜波長的紅色激光后多種細菌的生長，即使當致敏底物，如脫礦牙本質(zhì)、膠原酶存在的情況下，仍然具有抗菌作用，并且產(chǎn)生光敏作用的過程中對人角化上皮細胞和成纖維細

32、胞不會產(chǎn)生毒性作用。此外，其價格較低，便于推廣普及。</p><p>　　本實驗掃描電鏡圖片結果顯示：實驗組變形鏈球菌形態(tài)與對照組相比有明顯變化。對照組變形鏈球菌菌體外形清晰，菌細胞表面光滑連續(xù)、無缺損；實驗組變形鏈球菌雖然菌體外形清晰，但大部分菌細胞表面粗糙不平，有水泡狀凸起，菌細胞周圍有散在的不定形物質(zhì)溢出，說明細胞壁和細胞膜接觸結構被破壞，由于胞內(nèi)物質(zhì)的喪失而導致細菌包膜和體積的減少。</p>

33、<p><b>　　參考文獻：</b></p><p>　　Alexiades-Armenakas M. Laser-mediated photodynamic therapy[J]. Clin Dermatol, 2006, 24(1):16-25.</p><p>　　Pagonis T C, Chen J, Fontana C R, et al. N

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