豬鏈球菌噬菌體SMP的抑菌作用及其增殖動(dòng)力學(xué)研究.pdf

1、豬鏈球菌病一直是困擾養(yǎng)豬業(yè)的重要疾病,特別是隨著抗生素的濫用,豬鏈球菌對(duì)抗生素呈現(xiàn)嚴(yán)重耐藥和多重耐藥,給該病的防控帶來新的困難。開發(fā)新型抗菌制劑顯得非常重要,而噬菌體作為抗菌制劑頗具應(yīng)用潛力。本文通過對(duì)豬鏈球菌2型及其烈性噬菌體SMP全長基因序列的分析,建立了能同時(shí)檢測(cè)噬菌體和豬鏈球菌的通用PCR方法;并建立了能分別檢測(cè)豬鏈球菌2型或其噬菌體的快速熒光定量PCR方法;應(yīng)用豬鏈球菌攻擊CD1小鼠后,用豬鏈球菌烈性噬菌體SMP進(jìn)行治療,結(jié)果

2、顯示該噬菌體具有治療豬鏈球菌感染的可行性;初步探索了噬菌體與豬鏈球菌互作的動(dòng)力學(xué)關(guān)系,為進(jìn)一步應(yīng)用噬菌體進(jìn)行豬鏈球菌病治療奠定了基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)對(duì)豬鏈球菌噬菌體的分離存在很大難度,應(yīng)用雙層瓊脂培養(yǎng)法挑取噬菌斑的傳統(tǒng)分離方法具有諸多局限性,為了解決這一問題,以健康巴馬香豬鼻拭子樣本中分離出的一株SS2的烈性噬菌體SMP為模板,建立了豬鏈球菌2型及其噬菌體的通用PCR檢測(cè)技術(shù),該方法可以同時(shí)檢測(cè)細(xì)菌和噬菌體的存在與否。通過比較噬菌體SMP和其

3、他99株鏈球菌或噬菌體的基因組發(fā)現(xiàn),SMP雖然保守區(qū)段很多,但卻很短,其中主要有int、lysin等基因,而single strand binding gene在blast結(jié)果中顯得最保守。針對(duì)single-stand binding gene序列設(shè)計(jì)引物,建立了PCR檢測(cè)方法,可在豬鏈球菌和噬菌體SMP的目標(biāo)區(qū)段檢測(cè)到條帶,回收測(cè)序證明是目標(biāo)條帶,而在對(duì)照組大腸桿菌及其噬菌體中未發(fā)現(xiàn)條帶。通過優(yōu)化PCR反應(yīng)條件,檢測(cè)下限可達(dá)103cf

4、u/mL。應(yīng)用該方法可以同時(shí)篩選到噬菌體和相關(guān)宿主菌,可提高噬菌體的分離概率。進(jìn)一步通過200nm濾膜過濾,可實(shí)現(xiàn)噬菌體和細(xì)菌的分離,并可通過下述的噬菌體快速熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)確認(rèn)噬菌體的存在。通用檢測(cè)可實(shí)現(xiàn)對(duì)豬鏈球菌2型烈性噬菌體有無的快速初步鑒定,甚至溶源階段的噬菌體也可以檢測(cè)。利用該方法,可加快噬菌體的分離工作,比傳統(tǒng)的“盲傳”分離更加高效。另外,通用檢測(cè)方法可以應(yīng)用到前噬菌體分析中,這是首次提出用PCR進(jìn)行豬鏈球菌前噬菌體檢

5、測(cè)。為了評(píng)估烈性噬菌體在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中對(duì)豬鏈球菌2型的抑菌作用、研究噬菌體和豬鏈球菌2型互作后各自的消長情況,以評(píng)價(jià)烈性噬菌體對(duì)感染豬鏈球菌動(dòng)物的保護(hù)力,針對(duì)豬鏈球菌2型及其噬菌體SMP分別建立了快速熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)。本文使用豬鏈球菌溶菌酶釋放蛋白(Muramidase-released protein, MRP)毒力基因mrp作為豬鏈球菌檢測(cè)的目標(biāo)基因。結(jié)果顯示,豬鏈球菌快速熒光PCR檢測(cè)技術(shù)可以在30分鐘內(nèi)把豬鏈球菌2型鑒定出來并

6、實(shí)現(xiàn)定量,定量的下限低于30個(gè)模板每毫升，特異性實(shí)驗(yàn)顯示它可以很好地排除大腸桿菌及其噬菌體、枯草桿菌、金黃色葡萄球菌和其自身噬菌體SMP等的干擾。在噬菌體SMP快速熒光定量PCR檢測(cè)中,選用lysin作為目標(biāo)基因,同樣噬菌體SMP快速熒光PCR檢測(cè)可在30分鐘內(nèi)鑒定出SMP并實(shí)現(xiàn)定量,定量下限低于30個(gè)模板每毫升，特異性實(shí)驗(yàn)顯示它可以很好地排除大腸桿菌及其噬菌體、枯草桿菌、金黃色葡萄球菌和豬鏈球菌等的干擾。結(jié)合噬菌體SMP快速熒光定量P

7、CR檢測(cè)和豬鏈球菌與噬菌體通用檢測(cè),把豬鏈球菌與噬菌體通用檢測(cè)作為一級(jí)檢測(cè)、噬菌體SMP快速熒光定量PCR檢測(cè)作為二級(jí)檢測(cè),可以很方便地檢測(cè)到豬鏈球菌噬菌體,為噬菌體分離提供便利。通過計(jì)算噬菌斑、平板裂解、細(xì)菌與噬菌體共培養(yǎng)后的濁度測(cè)定可定性了解噬菌體SMP的殺菌能力。為了進(jìn)一步定量分析細(xì)菌與噬菌體的互作動(dòng)力學(xué)特征,本文進(jìn)行了細(xì)菌與噬菌體共培養(yǎng)的定量實(shí)驗(yàn)。將豬鏈球菌2型與噬菌體SMP共同培養(yǎng),每隔一定時(shí)間取樣,使用熒光定量PCR測(cè)算細(xì)菌

8、與噬菌體的數(shù)量。為了更好地研究噬菌體與其宿主菌的動(dòng)態(tài)關(guān)系,定量實(shí)驗(yàn)中建立了捕食者數(shù)學(xué)模型,并根據(jù)定量實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù),擬合出結(jié)果。定性實(shí)驗(yàn)和定量試驗(yàn)都顯示噬菌體SMP具有良好的殺菌和抑菌能力,這為SMP的治療性應(yīng)用提供了可能。數(shù)學(xué)模型擬合結(jié)果顯示SMP與其宿主菌可以適用捕食者模型,首次提出用生態(tài)數(shù)學(xué)模型來模擬微生物之間的關(guān)系,為噬菌體與其宿主菌的互作關(guān)系研究提出一條可行性路線,為應(yīng)用噬菌體治療提供了理論基礎(chǔ)。為了研究噬菌體SMP對(duì)豬鏈球菌感染

9、的治療作用,確認(rèn)SMP對(duì)感染豬鏈球菌2型的動(dòng)物具有保護(hù)力,進(jìn)行了小鼠攻擊保護(hù)試驗(yàn)。以CD1小鼠作為模式動(dòng)物,在用豬鏈球菌攻擊后,采用靜脈注射SMP進(jìn)行噬菌體體內(nèi)抗菌活性研究。通過統(tǒng)計(jì)噬菌體處理組和細(xì)菌攻擊對(duì)照組小鼠體內(nèi)的細(xì)菌增殖情況,揭示了噬菌體對(duì)活體動(dòng)物具有殺菌效果。試驗(yàn)研究了噬菌體SMP對(duì)豬鏈球菌SS2-4的抗感染效果。將小鼠分為4組,分別是PBS陰性對(duì)照、噬菌體對(duì)照、細(xì)菌攻擊對(duì)照、細(xì)菌攻擊后噬菌體處理。采用尾靜脈注射,每隔一定時(shí)間