水產(chǎn)品中產(chǎn)組胺微生物的分離與生物學(xué)特性【畢業(yè)設(shè)計(jì)】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)設(shè)計(jì)</b></p><p><b>　?。?0_ _屆）</b></p><p>　　水產(chǎn)品中產(chǎn)組胺微生物的分離與生物學(xué)特性</p><p>　　所在學(xué)院 </p><p>　　專業(yè)班級(jí) 食品

2、科學(xué)與工程 </p><p>　　學(xué)生姓名 學(xué)號(hào) </p><p>　　指導(dǎo)教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p><b>　　目　錄</b>

3、</p><p><b>　　誠(chéng)信承諾I</b></p><p><b>　　目錄II</b></p><p><b>　　摘要IV</b></p><p>　　1 前言錯(cuò)誤!未定義書簽。</p><p>　　2 材料與方法錯(cuò)誤!未定義書簽。&

4、lt;/p><p>　　2.1 實(shí)驗(yàn)材料錯(cuò)誤!未定義書簽。</p><p>　　2.1.1原料錯(cuò)誤!未定義書簽。</p><p>　　2.1.2儀器與設(shè)備錯(cuò)誤!未定義書簽。</p><p>　　2.1.3試劑和培養(yǎng)基2</p><p>　　2.2測(cè)定方法3</p><p>　　2.

5、2.1鰹魚成分分析3</p><p>　　2.2.2高效液相色譜法測(cè)定組胺3</p><p>　　2.2.3J2菌株的生理生化實(shí)驗(yàn)4</p><p>　　2.3 實(shí)驗(yàn)方法5</p><p>　　2.3.1組胺生成菌的分離篩選5</p><p>　　2.3.2J2菌株生長(zhǎng)曲線5</p>

6、<p>　　2.3.3環(huán)境因素對(duì)J2菌株生長(zhǎng)的影響5</p><p>　　2.3.3.1 溫度對(duì)J2菌株生長(zhǎng)的影響5</p><p>　　2.3.3.2 pH值對(duì)J2菌株生長(zhǎng)的影響5</p><p>　　2.3.4環(huán)境因素對(duì)J2菌株組胺生成量的影響6</p><p>　　2.3.4.1 溫度對(duì)J2菌株組胺生成量的影響

7、6</p><p>　　2.3.4.2 pH值對(duì)J2菌株組胺生成量的影響6</p><p><b>　　3結(jié)果與分析6</b></p><p>　　3.1 鰹魚成分分析6</p><p>　　3.2 組胺生成菌的分離篩選6</p><p>　　3.3 待測(cè)菌株產(chǎn)組胺能力測(cè)定6</

8、p><p>　　3.4 J2菌株生長(zhǎng)曲線7</p><p>　　3.5 J2菌株生理生化實(shí)驗(yàn)7</p><p>　　3.6 環(huán)境因素對(duì)J2菌株生長(zhǎng)的影響7</p><p>　　3.6.1溫度對(duì)J2菌株生長(zhǎng)的影響7</p><p>　　3.6.2pH值對(duì)J2菌株生長(zhǎng)的影響8</p><p>

9、;　　3.7 環(huán)境因素對(duì)J2菌株組胺生成量的影響8</p><p>　　3.7.1溫度對(duì)J2菌株組胺生成量的影響8</p><p>　　3.7.2pH值對(duì)J2菌株組胺生成量的影響9</p><p><b>　　4 結(jié)論9</b></p><p><b>　　參考文獻(xiàn)10</b><

10、/p><p><b>　　致謝11</b></p><p>　　【摘要】鑒別培養(yǎng)基初步篩選共得到10株菌株，并且利用高效液相色譜法檢測(cè)到其中一株菌株在含1.0%L-組氨酸胰酶蛋白大豆肉湯中有組胺產(chǎn)生。對(duì)水產(chǎn)品中的組胺生成菌進(jìn)行生化實(shí)驗(yàn)和環(huán)境因素對(duì)其生長(zhǎng)和組胺生成量的影響實(shí)驗(yàn)，為生產(chǎn)實(shí)踐中組胺的控制提供可參考數(shù)據(jù)。該菌株的最適生長(zhǎng)溫度和pH分別為30℃ 和 7。同時(shí)，25

11、℃檢測(cè)到該菌株組胺最大生成量5.49ug/ml，pH為5時(shí)檢測(cè)到組胺最大生成量9.86ug/ml。該菌株初步鑒定為芽孢桿菌(Bacillus spp)。</p><p>　　【關(guān)鍵詞】水產(chǎn)品；組胺生成菌；生物化學(xué)</p><p>　　【ABSTRACT】A total of ten bacterial strains were selected from the prescreening

12、step using preliminarily differential medium, and one of the positive isolates were true histamine formers when confirmed by HPLC method in trypticase soy broth supplemented with 1.0% L-histidine. The physiological and b

13、iochemical experiments and environmental factors on growth and histamine formation of histamine-forming bacteria were conducted to provide reference data for histamine control in production. The optimu</p><p&g

14、t;　　【KEYWORDS】Aquatic products; histamine forming bacteria;biochemistry</p><p><b>　　1前言</b></p><p>　　自從中國(guó)加入世界貿(mào)易組織，對(duì)外開放制度不斷加強(qiáng)，大力發(fā)展對(duì)外貿(mào)易，特別是發(fā)展出口貿(mào)易，其中水產(chǎn)品的出口也不斷增加。但是水產(chǎn)品的安全問題，一直是制約其出口的主要瓶頸

15、。這主要是由于水產(chǎn)品衛(wèi)生指標(biāo)控制不到位及國(guó)內(nèi)外對(duì)水產(chǎn)品微生物控制的柵欄技術(shù)應(yīng)用研究缺乏充分的微生物分類鑒定研究證據(jù)，從而不能從根本上解決產(chǎn)品衛(wèi)生安全問題和建立有效的控制方法。</p><p>　　組胺是水產(chǎn)品貯藏或加工過程中體內(nèi)組氨酸經(jīng)過生物化學(xué)過程（部分消化酶分解）和外源性微生物污染后產(chǎn)生的蛋白酶類（蛋白酶主要是脫羧酸酶類）降解魚肉組織后產(chǎn)生的對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)（感官指標(biāo)）劣化或人體有一定毒害的化學(xué)物質(zhì)[1]。海產(chǎn)魚類

16、如鮐魚、鰹魚、青魚、沙丁魚、竹夾魚、金槍魚、秋刀魚、沙丁魚、朝鮮方魚等由于體內(nèi)含有組氨酸，被組胺無色桿菌，摩根氏變形桿菌等微生物污染后，會(huì)產(chǎn)生一定數(shù)量的組胺類成分。而組胺是人體引起炎癥和過敏性疾病的主要物質(zhì)，它可使病人支氣管收縮和粘液分泌，患者接觸變性原后，血清和支氣管肺泡灌洗液中可見組胺水平增高[2-4]。嚴(yán)重的組胺中毒是由于食用含有一定數(shù)量組胺的某些魚類以及其他動(dòng)物而引起的過敏性食物中毒。由于組胺產(chǎn)生的事物過敏，甚至中毒的現(xiàn)象屢見不

17、鮮。</p><p>　　微生物污染產(chǎn)生組胺的三個(gè)條件[5-6]：（1）存在組胺的前體物質(zhì)——自由組氨酸；（2）存在催化酶——組氨酸脫羧酶（主要由微生物產(chǎn)生）；（3）存在發(fā)生組氨酸脫羧反應(yīng)的條件。水產(chǎn)魚類，尤其是中上層的青皮紅肉魚，體內(nèi)含有豐富的自由組氨酸。一旦此類魚或其產(chǎn)品中存在產(chǎn)組胺微生物，在適宜條件下，極易產(chǎn)生組胺。它們廣泛存在于未經(jīng)加工的魚或其產(chǎn)品（發(fā)酵、腌漬、干制和其它魚肉制品）中。</p>

18、<p>　　迄今為止，國(guó)內(nèi)對(duì)組胺控制研究一直不夠深入，大部分僅僅局限于測(cè)定組胺含量的層面上，只有少數(shù)人對(duì)組胺的形成和控制做了研究。有相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)水產(chǎn)品中組胺的產(chǎn)生機(jī)理，以及影響組胺產(chǎn)生的因素（包括溫度、p H 值、貯藏時(shí)間、含鹽度、供氧量以及添加劑）分別做了概述。另外，還有文獻(xiàn)報(bào)道，不同種類的海魚在不同發(fā)酵溫度、不同腐敗程度、以及不同NaCl含量的條件下，對(duì)組胺產(chǎn)生規(guī)律做了詳細(xì)研究，但并未對(duì)產(chǎn)組胺菌進(jìn)行鑒定，并給出相應(yīng)控制方

19、法。本課題就從微生物角度研究入手，采用現(xiàn)代微生物分離鑒定技術(shù)，找到特定水產(chǎn)品中產(chǎn)生組胺的主要微生物，研究它們的生理生化特性、環(huán)境因素對(duì)其生長(zhǎng)和產(chǎn)酶活性的影響。通過分析所得數(shù)據(jù)，再探討它們之間的相互關(guān)系，制定出相應(yīng)控制方法，為生產(chǎn)實(shí)踐中組胺的控制提供技術(shù)支持。</p><p><b>　　2 材料與方法</b></p><p><b>　　2.1 實(shí)驗(yàn)材料&l

20、t;/b></p><p><b>　　2.1.1 原料</b></p><p>　　冷凍鰹魚（捕撈后-30℃速凍，-18℃保藏），浙江舟山企業(yè)提供（2010年4月）。此鰹魚捕撈于中國(guó)東海。</p><p>　　2.1.2 儀器與設(shè)備</p><p>　　其他儀器：量筒、離心管、燒杯、移液管、三角錐形瓶、試管、試劑

21、瓶、滴定管、容量瓶、玻璃棒、培養(yǎng)皿、移液槍、剪刀、酒精燈、鑷子、牙簽等。</p><p>　　2.1.3 試劑和培養(yǎng)基</p><p><b>　　試劑：</b></p><p><b>　　培養(yǎng)基：</b></p><p>　　普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化鈉5g，瓊脂15g，

22、蒸餾水1000ml，加熱溶化，調(diào)pH 7.2，冷卻至40~50℃保存?zhèn)溆谩?lt;/p><p>　　初步篩選培養(yǎng)基：胰蛋白胨5g，酵母膏5g，L—組氨酸2g，NaCl5g，瓊脂15g，甲酚紅0.2g，蒸1000ml，</p><p>　　加熱溶化，調(diào)pH 6.5，121℃滅菌15min，冷卻至40～50℃保存?zhèn)溆谩?lt;/p><p>　　運(yùn)動(dòng)性檢測(cè)培養(yǎng)基：蛋白胨5g，牛肉

23、膏2.5g，酵母2.5g，葡萄糖1g，瓊脂20g，海水500ml，蒸餾水500ml，加熱溶化后，調(diào)pH 7.0，分裝試管，121℃蒸汽滅菌20min，冷卻后備用。</p><p>　　產(chǎn)酸產(chǎn)氣檢測(cè)培養(yǎng)基：蛋白胨10g，酵母3g，葡萄糖5g，組氨酸5g，海水500ml，蒸餾水500ml，調(diào)pH 6.5，分裝裝有小導(dǎo)管的試管，12l℃蒸汽滅菌20min，冷卻后備用。</p><p>　　淀粉水

24、解培養(yǎng)基：蛋白胨10g，氯化鈉5g，牛肉膏5g，可溶性淀粉2g，蒸餾水1000ml，瓊脂15g，121℃蒸汽滅菌20min，冷卻至40～50℃保存?zhèn)溆谩?lt;/p><p>　　蛋白胨水培養(yǎng)基：蛋白胨10g，氯化鈉5g，蒸餾水1000ml，調(diào)pH 7.5，分裝試管，121℃蒸汽滅菌20min冷卻后備用。</p><p>　　葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基：蛋白胨5g，葡萄糖5g，磷酸氫二鉀2g，蒸餾水1

25、000ml，調(diào)pH 7.2，分裝試管，112℃蒸汽滅菌20min，冷卻后備用。</p><p>　　明膠液化檢測(cè)培養(yǎng)基：牛肉膏0.3g，蛋白胨1g，氯化鈉 0.5g，明膠15g，蒸餾水100ml，加熱溶化后，調(diào)調(diào)pH 7.2，分裝試管，121℃蒸汽滅菌20min，冷卻后備用。</p><p>　　初步篩選培養(yǎng)基：胰蛋白胨5g，酵母膏5g，L—組氨酸2g，NaCl5g，瓊脂15g，甲酚紅0.

26、2g，蒸餾水1000ml，加熱溶化，調(diào)pH6.5，121℃滅菌15min，冷卻至40～50℃保存?zhèn)溆谩?lt;/p><p>　　L—組氨酸胰酪胨大豆肉湯發(fā)酵培養(yǎng)基：L—組氨酸10g，大豆蛋白胨17g，NaCl 3.0g，磷酸氫二鉀2.5g，丙酮酸鈉10.0g，葡萄糖2.5g，蒸餾水1000ml，調(diào)pH 7.0，分裝試管，121℃蒸汽滅菌15min，冷卻后備用。</p><p><b>

27、;　　2.2 測(cè)定方法</b></p><p>　　2.2.1鰹魚成分分析</p><p><b>　　鰹魚pH的測(cè)定：</b></p><p>　　將10g魚肉組織勻漿與90ml蒸餾水混合，制成較稠的漿液，用一臺(tái)pH計(jì)測(cè)定。</p><p><b>　　鰹魚鹽分的測(cè)定：</b><

28、/p><p>　　樣品處理：按固液比例，取具有代表性樣品至少200g，去除不可食部分，用研缽或組織搗碎機(jī)搗碎，混勻。取樣品5g于30ml瓷坩堝中，在130℃烘箱中烘干。在電爐上碳化至無煙，放入550~600℃高溫爐中灼燒2h，取出放冷后，在坩堝內(nèi)加入少量水用玻璃棒搗碎并研磨均勻轉(zhuǎn)移入100ml容量瓶中定容至刻度，混勻，過濾，取濾液備用。</p><p>　　滴定：準(zhǔn)確移取制備的樣品液適量（含氯

29、化鈉50~100mg，含量低的樣品可采用全量分析），于250ml三角瓶中，加水至約100ml（必要時(shí)，加2~3滴百里香酚藍(lán)指示劑，用0.1mol/LHNO3或0.1mol/ LNaOH滴定至剛顯淡藍(lán)色，pH值在6.5~10.5之間），加0.5ml 10%鉻酸鉀指示劑，用0.1mol/L的硝酸銀標(biāo)準(zhǔn)液滴定至剛顯磚紅色為終點(diǎn)，同時(shí)做一試劑空白對(duì)照。</p><p>　　鰹魚水分含量的測(cè)定：</p>&l

30、t;p>　　稱量皿稱取一定量的樣品，記錄質(zhì)量，后將稱量皿放入烘箱內(nèi)，蓋子應(yīng)該打開，斜放在旁邊，取出時(shí)先改好蓋子，用紙條取，放入干燥器內(nèi)，冷卻后稱重。干燥溫度設(shè)定為105℃，每隔一定時(shí)間稱量一次，直至最后兩次重量之差<2mg，基本保證水分蒸發(fā)完全。</p><p>　　鰹魚揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定：</p><p>　　樣品處理：將鰹魚除去不可食部分，絞碎攪勻，稱約10.0g，置于錐形

31、瓶中，加100ml水，不時(shí)震搖，浸漬30min后過濾，濾液置冰箱備用。</p><p>　　蒸餾滴定：將盛有10ml吸收液及5滴~6滴混合指示液的錐形瓶置于冷凝管下端，并使其下端插入吸收液的液面下，準(zhǔn)確吸取5.0ml上述試樣濾液于蒸餾器反應(yīng)室內(nèi)，加入5ml氧化鎂混懸液（10g/L），迅速蓋塞，并加水以防漏氣，通入蒸汽，進(jìn)行蒸餾，蒸餾5min即停止，吸收液用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液（0.010mol/L）或硫酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液

32、滴定，終點(diǎn)至藍(lán)紫色。同時(shí)做試劑空白試驗(yàn)。</p><p>　　2.2.2 高效液相色譜法測(cè)定組胺</p><p>　　無菌條件下，將待測(cè)菌株分別接種于10ml組胺發(fā)酵培養(yǎng)基中，并設(shè)置空白對(duì)照組（不接種細(xì)菌），均于35℃下靜置培養(yǎng)24h。</p><p>　　發(fā)酵液預(yù)處理[7]：</p><p>　　取各菌株發(fā)酵液及空白對(duì)照各1ml于5ml離心

33、管中，同時(shí)分別取組胺標(biāo)準(zhǔn)使用液0μl，50μl，100μl，200μl（濃度10mg/L）也于5ml離心管中，用去離子水定容1ml。再依次加入100μl 2mol/L氫氧化鈉（標(biāo)準(zhǔn)品不加），20ul內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)使用液，300ul飽和碳酸氫鈉，再加入2ml丹酰氯衍生劑溶液進(jìn)行衍生，震蕩混勻后，隨后于40℃烘箱內(nèi)放置45min，再加入100μl氨水，再放置40min，最后用乙腈定容至5ml，震蕩混勻后，取1ml經(jīng)濾膜過濾后直接進(jìn)樣。</p

34、><p><b>　　色譜條件：</b></p><p>　　流動(dòng)相A：0.01mol/L乙酸銨，流動(dòng)相B：乙腈與0.01mol/L乙酸銨9:1混合。流動(dòng)相A：流動(dòng)相B=2:8，流速1.0ml/min，熒光檢測(cè)器波長(zhǎng)254nm。進(jìn)樣量:20μl。</p><p>　　2.2.3 J2菌株的生理生化實(shí)驗(yàn)</p><p><

35、;b>　　革蘭氏染色：</b></p><p>　　取菌落與生理鹽水（一滴綠豆大?。?~3環(huán)，自然風(fēng)干或者吹風(fēng)機(jī)輔助吹干，進(jìn)行染色。結(jié)晶紫染色1min，蒸餾水沖洗干凈，吹干；碘液染色1分鐘，蒸餾水沖洗干凈，周圍水珠擦掉，95%酒精沖洗，蒸餾水沖洗干凈，革蘭氏染液染色2min，蒸餾水沖洗干凈，吹干，將載玻片放于顯微鏡下觀察，滴一滴香柏油，觀察結(jié)果并記錄。</p><p>&

36、lt;b>　　接觸酶試驗(yàn)：</b></p><p>　　將24h培養(yǎng)的斜面菌種，用無菌牙簽取少量涂抹于已滴有3%過氧化氫的載玻片上，立即觀察結(jié)果，如有氣泡產(chǎn)生則為陽(yáng)性，不產(chǎn)生氣泡則為陰性。</p><p><b>　　氧化酶試驗(yàn)：</b></p><p>　　將24h培養(yǎng)的斜面菌種，用無菌牙簽取少量菌種取少量涂于無菌濾紙上，然

37、后滴加l％鹽酸二甲基對(duì)苯二胺溶液，10—15s內(nèi)呈紅色為陽(yáng)性，否則為陰性。</p><p><b>　　運(yùn)動(dòng)性的檢測(cè)：</b></p><p>　　用接種針取少量菌種，穿刺于運(yùn)動(dòng)性檢測(cè)培養(yǎng)基中，于25℃培養(yǎng)48h后觀察。在接種痕跡周圍生長(zhǎng)或使整個(gè)試管變渾濁的，具有運(yùn)動(dòng)性；只在接種痕跡處生長(zhǎng)的菌種，不具有運(yùn)動(dòng)性。</p><p><b>

38、;　　產(chǎn)酸產(chǎn)氣試驗(yàn)：</b></p><p>　　用接種環(huán)取少量菌種接種于產(chǎn)酸產(chǎn)氣檢測(cè)培養(yǎng)基中，于25℃培養(yǎng)48h后觀察，并用pH計(jì)測(cè)定試管內(nèi)的pH。試管內(nèi)小導(dǎo)管有氣體的為陽(yáng)性，否則為陰性。能使培養(yǎng)基pH改變一個(gè)單位或幾個(gè)單位的，表明能產(chǎn)酸，幾乎不改變（基本保持在原始pH6.5附近）的，表明不能產(chǎn)酸。</p><p><b>　　淀粉水解試驗(yàn)：</b>&l

39、t;/p><p>　　用接種環(huán)取少量菌種接種于淀粉培養(yǎng)基，35℃培養(yǎng)24h，將蓋子打開，加入Lugol，s碘液于平皿中，輕輕旋轉(zhuǎn)平板，使碘液覆蓋整個(gè)平皿，出現(xiàn)透明水解光圈的，為陽(yáng)性，否則為陰性。</p><p><b>　　M.R試驗(yàn)：</b></p><p>　　用接種環(huán)取少量菌種接種于葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)物內(nèi)，35℃培養(yǎng)48h后，加入甲基紅試劑2滴

40、，甲基紅變紅色者為陽(yáng)性，變黃色者為陰性。</p><p><b>　　V-P.試驗(yàn)：</b></p><p>　　用接種環(huán)取少量菌種接種于葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)物內(nèi)，35℃培養(yǎng)48h后，加入5滴40%氫氧化鉀，然后再加入五滴5%α—奈酚溶液，用力震蕩，再加入37℃恒溫箱中保溫30min，培養(yǎng)物呈紅色者，為陽(yáng)性反應(yīng)，否則為陰性。</p><p><

41、;b>　　吲哚實(shí)驗(yàn)：</b></p><p>　　將菌接種至蛋白胨水培養(yǎng)基中，37℃下培養(yǎng)48h以上。在培養(yǎng)液中加入乙醚1~2ml，靜置片刻后乙醚層浮于培養(yǎng)液的上面，此時(shí)沿管壁緩慢加入5~10滴吲哚試劑（加入吲哚試劑后切勿搖動(dòng)試管，以防破壞乙醚層影響結(jié)果觀察），如有吲哚存在，乙醚層呈現(xiàn)玫瑰紅色，此為吲哚試劑陽(yáng)性反應(yīng)，否則為陰性反應(yīng)。</p><p>　　明膠液化試驗(yàn)：用接

42、種針取少量菌種，穿刺于明膠培養(yǎng)基中，于25℃培養(yǎng)后，由于明膠在此溫度下自行液化，先置4℃冰箱內(nèi)30min，再觀察。部分明膠成流動(dòng)狀態(tài)者，為陽(yáng)性，否則為陰性。</p><p><b>　　2.3 實(shí)驗(yàn)方法</b></p><p>　　2.3.1 組胺生成菌的分離篩選</p><p>　　無菌條件下，將冷凍（-18℃以下）鰹魚的魚鰓或內(nèi)臟取出后，用

43、滅菌剪刀剪碎，稱取10.0g置于裝有90.0ml無菌生理鹽水的三角瓶中，混合均勻。將三角瓶置于35℃下，過夜培養(yǎng)。</p><p>　　將過夜培養(yǎng)的樣品依次稀釋10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6后，取0.1ml稀釋液涂布于初步鑒別培養(yǎng)基平板上，35℃下，培養(yǎng)24h，如果菌落周圍出現(xiàn)紅色或紫色暈環(huán)，則可能為組胺生成菌株[8]，在初步鑒別培養(yǎng)基上，純化兩次以上，作為待測(cè)菌株，備用于高效液相色譜

44、法測(cè)定其產(chǎn)組胺能力的實(shí)驗(yàn)。</p><p>　　2.3.2 J2菌株的生長(zhǎng)曲線</p><p>　　將J2菌液接種至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，準(zhǔn)確測(cè)定菌液濃度后，無菌水稀釋到10-4左右，接種到50ml營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，30℃下培養(yǎng)，接種量為1ml。根據(jù)其渾濁度，每2h無菌水進(jìn)行梯度稀釋10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10，

45、分別取等量不同稀釋梯度菌液到培養(yǎng)皿中，加入冷卻至55-60℃培養(yǎng)基，置水平位置迅速旋轉(zhuǎn)平皿，使?fàn)I養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基與菌液混合均勻。倒置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后，菌落計(jì)數(shù)，并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。</p><p>　　2.3.3 環(huán)境因素對(duì)J2菌株生長(zhǎng)的影響</p><p>　　加工和貯藏環(huán)境條件不但影響組胺產(chǎn)生菌的活性，同時(shí)也能夠影響組胺酸脫羧酶的活性，這些條件主要包括溫度、pH值、貯藏時(shí)間、含鹽度

46、、供氧量以及添加劑等[9]。本文主要研究了溫度[10]、pH[11]這兩個(gè)因素。</p><p>　　2.3.3.1 溫度對(duì)J2菌株生長(zhǎng)的影響</p><p>　　將J2菌液接種至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，培養(yǎng)液在渦旋振蕩器上混合均勻，準(zhǔn)確測(cè)定菌液濃度后，進(jìn)行系列稀釋至10-6，將10-4、10-5、10-6稀釋梯度的菌液分別進(jìn)行五組倒平板。將培養(yǎng)基加熱溶化，待冷至55-60℃倒入培養(yǎng)基

47、于無菌培養(yǎng)皿中，每個(gè)約15ml ，置水平位置迅速旋轉(zhuǎn)平皿，使?fàn)I養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基與菌液混合均勻。然后分別將這五組放置于4℃（冰箱控制溫度），20℃，25℃，30℃，35℃下靜置培養(yǎng)36h（每個(gè)溫度均設(shè)置空白對(duì)照），菌落計(jì)數(shù)，并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。</p><p>　　2.3.3.2 pH值對(duì)J2菌株生長(zhǎng)的影響</p><p>　　制備pH 4，5，6，7，8的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。無菌操作將J2菌液接種至營(yíng)

48、養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h后，將培養(yǎng)液在渦旋振蕩器上混合均勻，準(zhǔn)確測(cè)定菌液濃度后，進(jìn)行系列稀釋至10-6，將10-4、10-5、10-6稀釋梯度的菌液分別進(jìn)行五組倒平板。將培養(yǎng)基加熱溶化，待冷至55-60℃倒入培養(yǎng)基于無菌培養(yǎng)皿中，每個(gè)約倒15ml ，置水平位置迅速旋轉(zhuǎn)平皿，使?fàn)I養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基與菌液混合均勻，置30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36h，菌落計(jì)數(shù)，并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。</p><p>　　2.3.4 環(huán)境因素對(duì)J2菌株組胺

49、生成量的影響</p><p>　　2.3.4.1 溫度對(duì)J2菌株組胺生成量的影響</p><p>　　將J2菌液混勻后等量接種于裝有含1.0%組胺酸胰酶蛋白大豆肉湯培養(yǎng)基[12]的試管中，并置于4℃，20℃，25℃，30℃，35℃下靜置培養(yǎng)36h（每個(gè)溫度均設(shè)置空白對(duì)照），測(cè)定培養(yǎng)液中組胺的含量，其中4℃為將試管放在冰箱中培養(yǎng)，其余溫度用培養(yǎng)箱控制，此時(shí)pH為7.4。測(cè)定組胺含量的方法見2

50、.2.5。</p><p>　　2.3.4.2 pH值對(duì)J2菌株組胺生成量的影響</p><p>　　首先將含1%L—組氨酸胰酶蛋白大豆肉湯培養(yǎng)基的pH調(diào)至4，5，6，7，8[13]，然后將J2菌液混勻后等量接種于裝有5ml培養(yǎng)基的試管中，35℃下靜置培養(yǎng)36h（每個(gè)pH均設(shè)置空白對(duì)照），測(cè)定培養(yǎng)液中組胺的含量。測(cè)定組胺方法見2.2.5。</p><p><b

51、>　　3 結(jié)果與分析</b></p><p>　　3.1 鰹魚成分分析</p><p>　　對(duì)鰹魚pH值、鹽分、水分含量和揮發(fā)性鹽基氮（TVBN）含量分別進(jìn)行了測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見表3-1。</p><p>　　表3-1 鰹魚成分分析結(jié)果</p><p>　　一般在低溫有氧條件下，魚類揮發(fā)性鹽基氮的量達(dá)到30mg/100g，即認(rèn)

52、為是變質(zhì)的標(biāo)志。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，此原料新鮮可用。鹽分的測(cè)定可為微生物生長(zhǎng)條件的研究提供一定依據(jù)。金槍魚類的肉質(zhì)大部分都是呈酸性的[14]，其pH保持在5.80左右，原因是貯藏在較低溫度下，魚肉內(nèi)90%以上的水分已凍結(jié)，肌球蛋白的ATP酶與微生物的作用受到抑制，但也一定程度上表明魚體凍藏前的新鮮程度[15]。</p><p>　　3.2組胺生成菌的分離篩選</p><p>　　經(jīng)過初步鑒別培

53、養(yǎng)基的篩選，從腮中篩選出微生物并編號(hào)為X1、X2、X3、X4、X5，從內(nèi)臟中篩選出微生物并編號(hào)為J1、J2、J3、J4、J5，共10株菌。</p><p>　　3.3 待測(cè)菌株產(chǎn)組胺能力測(cè)定</p><p>　　利用高效液相色譜法[16]，對(duì)篩選出的待測(cè)菌株X1-X5，J1-J5進(jìn)行產(chǎn)組胺能力的測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見表3-2。</p><p>　　表3-2 10株菌的產(chǎn)組

54、胺能力測(cè)定結(jié)果</p><p>　　注：“一”表示未檢測(cè)到組胺，“+”表示檢測(cè)組胺量較少，“++”表示檢測(cè)組胺量較多。</p><p>　　由上表可知，只有J2菌株檢測(cè)到少量組胺，但由于生理生化反應(yīng)顯示J1、J2、J3、J4可能為同一株菌屬，所以分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生原因可能是菌株培養(yǎng)時(shí)間較短，以致產(chǎn)生的組胺量較少，從而影響了高效液相的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。選擇J2作為后面研究的菌株。</p>

55、<p>　　3.4 J2菌株生長(zhǎng)曲線</p><p>　　根據(jù)J2菌液的濃度每2h進(jìn)行稀釋倒平板，放置30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后[17-18]，菌落計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3-1。</p><p>　　圖3-1 J2的生長(zhǎng)曲線</p><p>　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，J2在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)，0~4h時(shí)生長(zhǎng)速率非常慢，這個(gè)時(shí)期為遲緩期；4~16h生長(zhǎng)速率最快，菌體

56、量呈典型的對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，這一階段即為它的指數(shù)生長(zhǎng)期；16~24h菌體量隨時(shí)間延長(zhǎng)基本保持平衡，即處于正生長(zhǎng)與負(fù)生長(zhǎng)相等的動(dòng)態(tài)平衡中，在18h菌體量達(dá)到最大值，lg細(xì)胞數(shù)（個(gè)/ml）為12.86。這一階段為它的穩(wěn)定期。</p><p>　　3.5 J2菌株生理生化反應(yīng)</p><p>　　對(duì)J2菌株進(jìn)行生化特性鑒定，共檢測(cè)13項(xiàng)生化指標(biāo)，試驗(yàn)結(jié)果見表3-3。</p><p&g

57、t;　　表3-3 J2菌株生理生化試驗(yàn)結(jié)果</p><p>　　注：“-”為陰性，“+”為陽(yáng)性。</p><p>　　分析：通過形態(tài)觀察、生長(zhǎng)特征、生理生化指標(biāo)測(cè)定，初步判定J2菌株為芽孢桿菌(bacillus spp.)。</p><p>　　3.6 環(huán)境因素對(duì)J2菌株生長(zhǎng)的影響</p><p>　　3.6.1 溫度對(duì)J2菌株生長(zhǎng)的影響&l

58、t;/p><p>　　準(zhǔn)確測(cè)定J2菌液濃度后，將菌液梯度稀釋后，取等量倒平板，分別放置在4℃（冰箱控制溫度），20℃，25℃，30℃，35℃下靜置培養(yǎng)36h（每個(gè)溫度均設(shè)置空白對(duì)照），菌落計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3-2。</p><p>　　由圖3-2可以看出，4~35℃溫度范圍內(nèi)，J2菌株均可以生長(zhǎng)，且隨著溫度的升高，菌株生長(zhǎng)繁殖越快，其最適生長(zhǎng)溫度為30℃~35℃，最大生物量達(dá)到12.67log

59、CFU/ml，35℃生物量有所減少。 </p><p>　　圖3-2 溫度對(duì)J2生長(zhǎng)的影響</p><p>　　3.6.2 pH值對(duì)J2菌株生長(zhǎng)的影響</p><p>　　制備pH 4，5，6，7，8的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。準(zhǔn)確測(cè)定J2菌液濃度后，取等量稀釋菌液分別與不同pH值的培養(yǎng)基倒平板，放置在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36h，菌落計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3-3。</p

60、><p>　　圖3-3 pH值對(duì)J2生長(zhǎng)的影響</p><p>　　由圖3-3可以看出，J2菌株在pH4~8范圍內(nèi)均可以生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)pH范圍為6~8，中性環(huán)境中生長(zhǎng)最好，而且J2在堿性環(huán)境中的生長(zhǎng)狀況好于酸性環(huán)境。</p><p>　　3.7環(huán)境因素對(duì)J2菌株組胺生成量的影響</p><p>　　3.7.1 溫度對(duì)J2菌株組胺生成量的影響&l

61、t;/p><p>　　將J2菌液混勻后，取等量接種于裝有含1.0%組胺酸胰酶蛋白大豆肉湯培養(yǎng)基的試管中，并置4℃，20℃，25℃，30℃，35℃下靜置培養(yǎng)36h（每個(gè)溫度均設(shè)置空白對(duì)照），測(cè)定培養(yǎng)液中組胺的含量，測(cè)定方法見2.2.2。</p><p>　　圖3-4 溫度對(duì)J2菌株產(chǎn)組胺的影響</p><p>　　其中 4℃時(shí)，組胺含量為0，表示冷藏狀態(tài)下沒有組胺產(chǎn)生。由

62、圖3-4可以看出，J2在20~35℃溫度范圍內(nèi)，組氨酸脫羧酶都有較強(qiáng)活性，且在25℃時(shí)活性最強(qiáng)，檢測(cè)到組胺最大生成量為5.49ug/ml,后隨著溫度的升高活性減弱。根據(jù)圖3-2分析可知，30℃菌株生長(zhǎng)繁殖最快，但組氨酸脫羧酶活性25℃后逐漸減弱。</p><p>　　3.7.2 pH值對(duì)J2菌株組胺生成量的影響</p><p>　　首先將含1.0%L—組氨酸胰酶蛋白大豆肉湯培養(yǎng)基的pH調(diào)至

63、4，5，6，7，8。然后將J2菌液混勻后等量接種于裝有5ml培養(yǎng)基的試管中，35℃下靜置培養(yǎng)36h（每個(gè)pH均設(shè)置空白對(duì)照），測(cè)定培養(yǎng)液中組胺的含量。測(cè)定組胺方法見2.2.2。</p><p>　　表3-5 pH值對(duì)J2菌株產(chǎn)組胺的影響</p><p>　　由圖3-5可以看出，J2菌株在pH4~8范圍內(nèi)均有組胺生成，且在pH為5時(shí)，有組胺最大生成量9.86ug/ml，后隨著pH值的增大，組

64、胺生成量逐漸減少。由pH值對(duì)組胺生成菌的影響實(shí)驗(yàn)可知，pH為7時(shí)，J2菌株繁殖量最多，但由于pH影響組氨酸脫羧酶的活性，故組胺產(chǎn)量較少。</p><p><b>　　4 結(jié)論</b></p><p>　　本實(shí)驗(yàn)對(duì)組胺生成菌J2的形態(tài)特征、環(huán)境因素對(duì)其生長(zhǎng)和組胺生成量的影響、生長(zhǎng)特征、生理生化指標(biāo)等進(jìn)行了研究。通過形態(tài)觀察、生理生化指標(biāo)測(cè)定，初步確定J2菌株為芽孢桿菌(

65、bacillus spp.)。J2菌株的最適生長(zhǎng)溫度為30℃，pH為7左右。并且該實(shí)驗(yàn)還分別證實(shí)了J2菌株組氨酸脫羧酶活性的最適溫度為25℃，pH為5。</p><p>　　要想更精確地確定J2的系統(tǒng)發(fā)育地位，還需要對(duì)它的16SrDNA寡核苷酸序列進(jìn)行分析。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1] Arai T

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