養(yǎng)殖對蝦病毒性流行病學調(diào)查及高通量基因檢測芯片的研究.pdf

1、隨著高密度集約化養(yǎng)殖模式的到來對蝦病毒性疾病對對蝦養(yǎng)殖業(yè)造成的損失正日益增大甚至嚴重制約了對蝦養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。對蝦病毒廣泛存在于對蝦養(yǎng)殖區(qū)近海海域的甲殼類體內(nèi),并且病毒傳播途徑復雜目前尚無特效的治療方法。經(jīng)過幾代水產(chǎn)科研人員多年對病原生物學的研究、示范養(yǎng)殖試驗,結合成功的養(yǎng)殖生產(chǎn)經(jīng)驗,認為只有從樹立健康養(yǎng)殖觀念,從養(yǎng)殖管理上,采取綜合預防措施,對養(yǎng)殖各階段的對蝦進行病原檢測從而有效地預防病毒病的發(fā)生。
　　 本論文首先進行了對蝦常

2、見病毒病的流行病學調(diào)查分析,基本了解了對蝦病毒病的發(fā)病趨勢。通過進行對蝦種類與病毒發(fā)病關系、養(yǎng)殖地區(qū)與病毒發(fā)病關系、養(yǎng)殖季節(jié)與病毒發(fā)病關系以及病毒陽性比率等方面的分析得出WSSV、IHHNV和HPV是對蝦病毒病中最主要的三種病原,其中WSSV的感染率占到了總病毒感染的50.52％,IHHNV和HPV分別占到了34.90％和11.98％。
　　 本論文根據(jù)Lightner藍皮書、國際獸疫局(OIE)水生動物疾病名錄、亞太水產(chǎn)養(yǎng)殖中

3、心網(wǎng)絡(NACA)水生動物疾病名錄等,選擇導致養(yǎng)殖對蝦類的發(fā)病的八種病毒作為研究對象,針對這些研究對象,在本實驗室先前設計篩選出的27對對蝦病毒擴增引物(其中每種對蝦對應三對特異引物)和對應的54條雜交探針中,按照退火溫度最接近和每條擴增片段大小容易通過瓊脂糖凝膠電泳區(qū)分的原則,并以實現(xiàn)病毒在同一單管中均能理想的進行多重PCR擴增為目的,對各病毒特異引物進行組合,最終獲得了一套既能實現(xiàn)單管多重PCR擴增又能獲得較理想基因芯片雜交結果的引

4、物和對應探針。
　　 本文針對多重RT-PCR檢測技術的需要,首先進行了對蝦病毒多重PER反應體系和反應條件的優(yōu)化,包括Mg2+濃度、酶濃度、退火溫度和反應循環(huán)數(shù)等,建立了一套對六種對蝦病毒-WSSV、IHHNV、HPV、TSV、BP、IMNV-同步擴增的多重PER和基因芯片技術。經(jīng)過多次反復優(yōu)化試驗,最終選擇50μL多重PCR反應體系中25mmol／LMg2+最佳用量為5.0μL,ExTaq酶最佳用量為0.75μL,反應程序中

5、最佳退火溫度為55.5℃。最后進行了多重PCR檢測方法靈敏度和特異性的驗證,并把該方法應用到了實際樣品檢測中。
　　 本研究利用基因芯片技術基本實現(xiàn)了八種對蝦病毒的同時檢測,進行了基因芯片陣列的設計。芯片陣列排列主要包括陽性質(zhì)控、陰性質(zhì)控、外質(zhì)控和內(nèi)質(zhì)控等組成的質(zhì)控系統(tǒng)以及由特異病毒探針組成的樣品雜交區(qū)；將多重RT-PCR技術與基因芯片相結合,實現(xiàn)了真正意義上的疾病高通量檢測。針對該技術本文進行了它的可行性、特異性以及應用性方面