豬早期妊娠診斷膠體金試紙條的研制.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、孕酮(Progesterone,簡稱P4)是一種甾體類激素,主要由黃體及胎盤產(chǎn)生。雌性動物性周期中孕酮水平呈規(guī)律性變化,發(fā)情期孕酮水平最低,黃體期孕酮水平較高,妊娠期孕酮水平則一直維持在較高水平上。傳統(tǒng)孕酮檢測采用放射免疫方法(RIA),但鑒于放射性免疫所需設(shè)備昂貴,放射物污染環(huán)境,不適宜在生產(chǎn)中推廣。本研究根據(jù)抗原抗體特異性結(jié)合原理制備膠體金試紙條,旨在為豬的早期妊娠診斷提供參考,該試紙條不需要專業(yè)人員即可使用,便于在市場推廣。本研究

2、通過孕酮人工抗原的合成和單克隆抗體的制備,組裝了可以用于豬早孕診斷的膠體金試紙條。
   1孕酮完全抗原的研制
   為了合成孕酮完全抗原,用O-羧甲基羥胺法將孕酮(P4)肟化,制備半抗原孕酮-3-(O-羧甲基)肟,采用薄層色譜法(TLC)和質(zhì)譜法鑒定半抗原結(jié)構(gòu);用混合酸酐法合成孕酮的完全抗原孕酮-牛血清白蛋白(P-BSA),孕酮-雞卵清白蛋白(P-OVA)。用紫外掃描和SDS-PAGE電泳對人工抗原進(jìn)行初步鑒定,再用免

3、疫學(xué)的方法對人工抗原進(jìn)行最終鑒定。TLC試驗(yàn)結(jié)果顯示孕酮的遷移率為0.4,合成物的遷移率為0.2,初步說明肟化成功,有肟化物產(chǎn)生。質(zhì)譜圖最強(qiáng)m/z386.2為孕酮-3-(O-羧甲基)肟的分子離子峰,與其理論分子量387.52基本一致,證明孕酮的衍生化是成功的。紫外全波長掃描的結(jié)果顯示BSA的最大吸收峰為278nm,而P-BSA的最大吸收峰偏移到255 nm,P-BSA的紫外全波長掃描的波形和BSA相比發(fā)生了明顯的變化;P-OVA的最大吸

4、收峰為255 nm,和OVA最大吸收峰278 nm相比發(fā)生了偏移,P-OVA的波形和OVA相比發(fā)生了明顯的變化。初步證明孕酮人工抗原的合成是成功的。
   結(jié)合紫外全波長掃描和考馬斯亮藍(lán)法估算P-BSA和P-OVA中半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)比率,測得P-BSA的偶聯(lián)比率為30∶1,P-OVA的偶聯(lián)比率是4∶1。用P-BSA免疫新西蘭大白兔4次后得到孕酮多克隆抗體,建立間接ELISA和間接競爭ELISA法檢測血清抗體效價(jià)和抗體競爭抑

5、制率。結(jié)果表明,免疫兔血清的效價(jià)達(dá)到了1∶219,兔血清多克隆抗體競爭抑制率(IC50)為207 ng/mL-間。最終證明該完全抗原可以刺激動物產(chǎn)生針對孕酮的高效價(jià)、高特異性的抗血清,半抗原孕酮-3-(O-羧甲基)肟和人工抗原P-BSA,P-OVA合成成功。
   2孕酮單克隆抗體的研制
   為了制備孕酮的單克隆抗體,用人工合成的孕酮-牛血清白蛋白(P-BSA)作為抗原免疫BALB/C小鼠4次后,取其中一只小鼠的脾細(xì)胞

6、,在PEG1450作用下與SP2/0細(xì)胞融合,與此同時(shí)建立檢測孕酮抗體的間接ELISA方法。利用雜交瘤技術(shù)和ELISA方法篩選得到1株穩(wěn)定分泌孕酮單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株2C11。用建立好的間接ELISA方法對其腹水進(jìn)行效價(jià)測定,其效價(jià)為1∶204800。對這株單抗進(jìn)行亞型鑒定,結(jié)果顯示其IgG1的OD450值0.481,Kappa的OD450值0.601,其余的亞型OD450值均小于0.2(OD450≥0.2判為陽性),說明雜交瘤細(xì)胞

7、2C11分泌的抗體亞型為IgG1,輕鏈類型為Kappa。將這株細(xì)胞經(jīng)體外傳代和多次凍存復(fù)蘇后,連續(xù)培養(yǎng)5天,其上清OD450均值分別為1.10、1.12、1.11、1.12、1.19,說明2C11抗體分泌穩(wěn)定。
   3檢測孕酮的膠體金試紙條的研制
   利用2C11雜交瘤細(xì)胞株的腹水單抗制備檢測孕酮的膠體金試紙條。采用免疫競爭法,將2C11分泌的單克隆抗體-膠體金復(fù)合物包被在膠體金結(jié)合墊上,單克隆抗體包被濃度為18μg

8、/mL。同時(shí)將人工合成的P-OVA以0.548 mg/mL包被在硝酸纖維素薄膜表面作為檢測線(T線),將孕酮單克隆抗體的羊抗鼠二抗以0.625 mg/mL包被在硝酸纖維素薄膜表面作為質(zhì)控線(C線)。T線的人工抗原與待檢樣品中的孕酮競爭結(jié)合膠體金標(biāo)記的孕酮單克隆抗體,通過T線是否顯色判斷陰陽性。采用該試紙條檢測樣品,整個(gè)檢測過程只需10 min,檢測限可以達(dá)到100 ng/mL,與睪酮,雌二醇無交叉反應(yīng)。說明檢測試劑具有較高的靈敏度及特異

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