奶牛乳腺組織miRNAs表達譜及基因BOLA-DQA2剪接體相關miRNAs分析.pdf

1、乳腺炎是現(xiàn)代奶牛業(yè)中一種常見的、復雜的炎癥性疾病，可造成重大的經濟損失。它受遺傳、環(huán)境等多種因素的影響，在其發(fā)生過程中有多種免疫相關基因參與。迄今為止，有關乳腺炎抗性分子機制尚不明了，特別是抗性相關基因的表達調控機制還不清楚。MicroRNA(miRNA)是一類長約22nt的內源性、非編碼RNAs，它可負調控基因轉錄后的表達，在免疫反應過程中有著重要作用;可變剪接(alternative splicing，AS)是在基因轉錄后水平上對基

2、因的一種調控機制，對基因生物功能的發(fā)揮有調控作用。為了探索在乳腺炎發(fā)生過程中，miRNA和可變剪接對免疫相關基因BOLA-DQA2的調控機制，以期了解乳腺炎的發(fā)病機理，豐富對奶牛乳腺炎抗性的認識。本文初步研究了miRNAs和可變剪接體與乳腺炎的關系。本論文分以下三部分:一奶牛乳腺組織miRNAs表達譜分析
　　 在真核細胞中，miRNA對基因表達調控具有重要作用。近年來，已在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)了許多的miRNAs。為了擴展miRNA

3、數(shù)量和分析乳腺組織miRNA表達與乳腺炎的潛在關系，本實驗采用Solexa測序方法檢測了患乳腺炎奶牛的乳腺組織miRNAs的表達譜，然后利用生物信息學的方法注釋miRNAs序列，結果共檢測出375個miRNAs序列，其中230個miRNAs為miRNA數(shù)據(jù)庫中已知的，145個為新miRNAs;鑒定出了1個新mirton和1個雙向轉錄miRNA。新發(fā)現(xiàn)的miRNAs可能為乳腺炎組織特異性表達的，可能在奶牛乳腺炎發(fā)生的過程中起著重要的作用。

4、本研究豐富了牛miRNAs數(shù)據(jù)庫，這些結果將促進哺乳動物基因組的功能注釋和miRNAs功能與比較基因組學的研究。
　　 二奶牛BOLA-DQA2基因可變剪接體與功能性SNPs的鑒定
　　 主要組織相容性復合體二類基因（MHC，major histocompatibility complex）在牛上也叫BOLA-DQA2，它參與免疫應答反應。為了探討B(tài)OLA-DQA2基因變異與奶牛乳腺炎抗性的關系，通過RT-PCR、克隆測

5、序及序列比對的方法，在奶牛乳腺組織鑒定出兩種BOLA-DQA2基因剪接體。其中，一種剪接體與NCBI參考序列一致，命名為BOLA-DQA2-complete;新的剪接體命名為BOLA-DQA2-SV1。剪接體BOLA-DQA2-SV1在exon3缺少195bp、在3'-UTR區(qū)缺少52bp和167bp。BOLA-DQA2-SV1通過提前引入終止密碼子，編碼了一個潛在的含有255個氨基酸的蛋白質。序列比對還鑒定出13個新的單核苷酸多態(tài)性(

6、SNPs)和多核苷酸多態(tài)性（MLNPs），其中4個SNPs和MLNPs導致蛋白潛在的保守區(qū)的氨基酸突變，且一個SNP(c.+1283C＞T)發(fā)生在bta-miR-2318種子序列區(qū)結合的區(qū)域，可能會影響bta-miR-2318與靶基因的結合。兩種剪接體在健康和患乳腺炎奶牛的乳腺組織中均有表達。在健康和患乳腺炎奶牛的乳腺組織中，BOLA-DQA2-SV1的表達量均顯著高于BOLA-DQA2-complete的表達量，表明BOLA-DQA2

7、-SV1是BOLA-DQA2基因的主轉錄本。BOLA-DQA2-SV1在患乳腺炎奶牛乳腺中的表達量呈2.67倍上調(p＜0.05)。上述結果提示，BOLA-DQA2-SV1可能在奶牛乳腺炎抗性方面扮演著重要的角色，而SNPs是否會影響B(tài)OLA-DQA2基因的結構以及它們與奶牛乳腺炎的關系還需做進一步研究。
　　 三 BOLA-DQA2基因不同剪接體靶標miRNAs的表達分析
　　 應用靶標miRNA預測軟件分析了與BOL

8、A-DQA2基因兩種剪接體的3'-UTR結合的miRNAs，并利用莖環(huán)-熒光定量PCR(Stem-loop-Q-PCR)分析了5個候選靶miRNAs在健康(n=5)和患乳腺炎奶牛(n=5)乳腺組織中的表達。預測結果顯示，靶向BOLA-DQA2-SV1基因的miRNAs數(shù)量比BOLA-DQA2-complete少;熒光定量結果表明，在患乳腺炎奶牛的乳腺組織中，5個潛在靶向BOLA-DQA2兩個轉錄本的miRNAs中，除了bta-miRNA