小鼠肝細(xì)胞胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的動(dòng)力學(xué)研究.pdf

1、目的：初步建立研究信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)磷蛋白質(zhì)組的方法，并應(yīng)用此方法初步鑒定幾種作為小鼠肝細(xì)胞胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的組成成分或效應(yīng)蛋白/酶的磷蛋白，對(duì)這些磷蛋白在持續(xù)高濃度的胰島素刺激不同時(shí)間點(diǎn)的磷酸化水平進(jìn)行半定量分析（獲得相對(duì)反應(yīng)速度數(shù)據(jù)），在細(xì)胞整體水平觀察細(xì)胞內(nèi)的激酶、信號(hào)蛋白在胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中發(fā)生的動(dòng)力學(xué)變化，以確定信號(hào)蛋白、信號(hào)途徑之間的相互交流、相互影響、相互作用和相互制約的關(guān)系及其對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)最終生理效應(yīng)的影響；方法：本實(shí)驗(yàn)采用組織

2、塊培養(yǎng)法，原代培養(yǎng)小鼠肝細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)材料，32P同位素標(biāo)記對(duì)照組與刺激組小鼠肝細(xì)胞磷蛋白，給予刺激組胰島素（100nmol/L）分別作用0min、5min、20min、60min、120min等不同時(shí)間長(zhǎng)度，液氮終止反應(yīng)，裂解細(xì)胞，收集蛋白，Bio-Rad DC法定量蛋白，根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和分子量的不同采用雙向電泳（一向采用pH3-10的固相pH梯度等電聚焦，二向采用10％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳）分離所得蛋白，固定凝膠塊后進(jìn)行干膠，將

3、干好的膠與X膠片一起放入攝影暗匣，在-70oC冰箱中曝光7日，于自動(dòng)洗片機(jī)內(nèi)沖洗X光膠片可得自顯影片，獲得電泳圖譜。采用PDQuest 2D分析軟件分析電泳圖譜中磷蛋白的等電點(diǎn)及分子量，將實(shí)驗(yàn)所得磷蛋白質(zhì)點(diǎn)與Swiss-Prot/TrEMBL蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)、PPDB及自建磷蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中小鼠肝細(xì)胞磷蛋白質(zhì)進(jìn)行分子量、等電點(diǎn)及磷酸化狀態(tài)的相互比較，初步確定小鼠肝細(xì)胞胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的組成成分或效應(yīng)蛋白/酶等相關(guān)磷蛋白，采用PDQuest 2

4、D分析軟件分析胰島素刺激不同時(shí)間點(diǎn)，蛋白質(zhì)磷酸化水平的變化，并繪制出相應(yīng)的時(shí)間動(dòng)力學(xué)曲線。結(jié)果：初步確定小鼠肝細(xì)胞胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)磷蛋白有EGFR底物15、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子、熱休克蛋白86、磷脂酰肌醇3激酶α調(diào)節(jié)亞基、蛋白激酶Cα、SHC、蛋白激酶B （PKB）、磷脂酰肌醇3激酶γ調(diào)節(jié)亞基、MAPK 信號(hào)整合激酶1、MAPK磷酸酶3、14-3-3蛋白α/β，糖代謝相關(guān)蛋白有糖原合酶底物（Glycogenin-1）等；獲得磷蛋白Shc、PKB

5、、MAPK磷酸酶3、Glycogenin-1、14-3-3α/β等的時(shí)間動(dòng)力學(xué)曲線，曲線均呈峰型，其中MAPK磷酸酶3的曲線高峰在5min ，Shc、PKB、Glycogenin-1、14-3-3α/β的曲線高峰在20min。結(jié)論：在細(xì)胞整體水平，持續(xù)高濃度的胰島素刺激下，磷蛋白不再表現(xiàn)為在純化體系時(shí)呈現(xiàn)的持續(xù)激活狀態(tài)，而是激活后很快恢復(fù)至低水平磷酸化狀態(tài)，表明在細(xì)胞整體水平，每個(gè)磷蛋白表現(xiàn)的動(dòng)力學(xué)行為是受到整個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)整合后的動(dòng)力