雷帕霉素對肺癌A549細(xì)胞球增殖和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用研究.pdf

1、肺癌發(fā)病率及死亡率近十年來呈現(xiàn)逐年遞增趨勢，成為嚴(yán)重威脅大眾健康的惡性腫瘤之一，肺癌轉(zhuǎn)移是防治的難點(diǎn)。因此，防止肺癌的轉(zhuǎn)移成為了目前肺癌治療中亟需面臨的一個(gè)重大問題?，F(xiàn)在普遍認(rèn)為，肺癌干細(xì)胞的存在是導(dǎo)致肺癌患者復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的主要原因，腫瘤干細(xì)胞不僅是腫瘤發(fā)生和發(fā)展的“種子”，而且是腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵所在，已有研究推測腫瘤干細(xì)胞可能是通過上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition，EMT）機(jī)制促進(jìn)肺癌轉(zhuǎn)移

2、，使肺癌細(xì)胞獲得遷移能力。哺乳類動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，作為細(xì)胞生長調(diào)控的中心因子和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子參與了細(xì)胞中多種病理生理過程，且其在細(xì)胞生長過程中主要參與基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的增殖和凋亡。進(jìn)一步研究證實(shí)，mTOR介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等功能紊亂不僅與多種惡性腫瘤和代謝性疾病有著密切關(guān)系，而且與EMT腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制之間也有著密不可分的聯(lián)系。

3、因此，推測 mTOR可作為治療腫瘤等疾病的潛在靶點(diǎn)。目前，雷帕霉素作為mTOR的特異性抑制劑，抑制mTOR信號通路在腫瘤中的作用已有相關(guān)報(bào)道。P70S6激酶（p70 ribosomal protein S6 kinase，P70S6K）是磷酸化后的mTOR直接作用的底物，其具有控制5’–TOP結(jié)構(gòu)的mRNA的翻譯的作用，而5’–TOP結(jié)構(gòu)的mRNA主要參與編碼核糖體蛋白，延伸因子等具有重要作用的順式作用元件。信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活子3(si

4、gnal transducer and ac-tivator of transcription3,STAT3)是高度保守的轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，細(xì)胞外的信號可以刺激其在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)發(fā)生磷酸化進(jìn)而轉(zhuǎn)運(yùn)至核內(nèi)，是信號傳導(dǎo)途徑中重要的核轉(zhuǎn)錄因子。大量研究證實(shí)STAT3蛋白在多種腫瘤細(xì)胞中呈持續(xù)激活狀態(tài)，被認(rèn)為是一種原癌基因，其不僅參與了細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡的調(diào)控，同時(shí)也參與了腫瘤血管發(fā)生、腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移及免疫逃逸等多個(gè)過程。近來的研究不斷證實(shí)S

5、TAT3蛋白的表達(dá)及磷酸化是依賴mTOR信號通路調(diào)控的。基于以上的研究事實(shí)，我們推測雷帕霉素可以通過抑制 mTOR信號通路，進(jìn)而影響mTOR信號通路下游的P70S6K及mTOR信號通路依賴的STAT3蛋白的表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移等，然而雷帕霉素在腫瘤干細(xì)胞中的作用仍不明確。本課題組前期利用無血清培養(yǎng)液分離和培養(yǎng)出富含肺癌干細(xì)胞的A549細(xì)胞球，較A549細(xì)胞具有更強(qiáng)的EMT能力。本研究利用雷帕霉素抑制A549細(xì)胞球中mTOR

6、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而抑制mTOR在A549細(xì)胞球增殖和EMT中發(fā)揮的調(diào)控作用，以期為尋找治療肺癌的潛在靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　目的：研究雷帕霉素干預(yù)肺癌干細(xì)胞球的作用及其相關(guān)機(jī)制
　　方法：應(yīng)用腫瘤干細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)A549細(xì)胞球，并采用FCM法檢測細(xì)胞球中CD133＋CD44＋細(xì)胞的比例。應(yīng)用20、50和100 ng/mL的雷帕霉素分別干預(yù)A549細(xì)胞球，蛋白質(zhì)印跡法檢測雷帕霉素對磷酸化哺乳類動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（phospho

7、-mammalian target of rapamycin，p-mTOR）蛋白表達(dá)的抑制程度，選出最佳抑制濃度。應(yīng)用最佳濃度的雷帕霉素干預(yù)A549細(xì)胞球24 h后，采用蛋白質(zhì)印跡法檢測EMT標(biāo)志物E-鈣黏蛋白（E-cadherin）和波形蛋白（vimentin）；同時(shí)檢測 mTOR下游通路磷酸化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和激活因子3（phospho-signal transducer and activator of transcription3，p-

8、STAT3）、磷酸化p70核糖體蛋白S6激酶（phospho-p70 ribosomal protein S6 kinase，p-p70S6K）和磷酸化真核細(xì)胞始動(dòng)因子4E結(jié)合蛋白1（phospho-4E binding protein1，p-4EBP1）的蛋白表達(dá)水平，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測干細(xì)胞標(biāo)志物Sox2、Oct4、CD133和Nanog的mRNA水平，MTT法檢測雷帕霉素干預(yù)1～7 d后A549細(xì)胞球的增殖能力，并應(yīng)用相差顯

9、微鏡觀察第14天時(shí)細(xì)胞球的大小。
　　結(jié)果：成功培養(yǎng)出懸浮生長的A549細(xì)胞球，F(xiàn)CM法檢測細(xì)胞球中CD133＋CD44＋細(xì)胞陽性率為（75.0±8.7）％；20、50和100 ng/mL的雷帕霉素均可抑制p-mTOR蛋白的表達(dá)（P＜0.05），以100 ng/mL的抑制效果最好。100 ng/mL雷帕霉素干預(yù)A549細(xì)胞球24 h后，E-cadherin蛋白的表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05），而 vimentin、p-STAT3