沉默食管癌EC9706細胞CD147表達的初步研究.pdf

1、背景和目的：CD147是于1982年發(fā)現(xiàn)的免疫球蛋白超家族的一員。最初人們認為CD147是一種能夠誘導基質金屬蛋白酶在成纖維細胞中表達的腫瘤表面蛋白,這種蛋白最初被命名為腫瘤細胞介導的膠原酶啟動因子(tumor cell collagenasestimulatory factor,TCSF)。隨著它的純系化,TCSF確定為一種與免疫球蛋白超家族(immunoglobulin superfamily,IgSF)的蛋白質有高度的同源性的跨膜

2、糖蛋白,并且能夠誘導基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)的產(chǎn)生。研究表明CD147在多種腫瘤中高表達,并且與腫瘤的侵潤轉移密切相關。但是它的表達不僅局限于腫瘤細胞。CD147是一種多效分子,CD147對于胎兒的發(fā)育和視網(wǎng)膜的功能起著至關重要的作用,并且已經(jīng)被證實在胸腺T細胞的發(fā)育過程中起作用。由于它表達的廣泛性和分子的多效性,研究CD147蛋白與蛋白之間的相互作用及其調控對腫瘤干預治療策略是十分重要

3、的。因此,本實驗擬構建針對CD147基因的siRNA表達載體,脂質體包裹轉染入人食管癌細胞株EC9706,檢測該細胞中CD147基因表達的沉默效果,初步觀察分析CD147基因表達沉默對食管癌EC9706細胞侵襲轉移能力的影響。
　　實驗方法：利用promega siRNA靶序列分析設計系統(tǒng),掃描人CD147 cDNA編碼序列(NM001728),依據(jù)siRNA靶序列設計原則,并且經(jīng)BLAST同源性分析,選擇確定3個針對CD147的

4、siRNA靶序列。分別合成3對靶向CD147 siRNA序列的發(fā)卡樣DNA單鏈,退火成雙鏈DNA,重組入siRNA表達載體pGeneClip中;利用PstⅠ酶切篩選鑒定重組子pGeneClip-si257、pGeneClip-si943和pGeneClip-si1203;以M13+/M13-為引物對重組子的插入序列進行DNA序列分析。利用脂質體包裹將siRNA表達載體pGeneClip-si257、pGeneClip-si943和pGe

5、neClip-si1203轉入人食管癌EC9706細胞中,同時設空載體對照組(轉染空載體pGeneClip)和空白對照組(未轉染);熒光定量RT-PCR方法和Western-Blot檢測各組細胞CD147mRNA和蛋白表達水平;ELISA方法檢測各組細胞的MMP-9水平;流式細胞術和細胞侵襲實驗(Matrigel Invasion Assay)檢測各組細胞的細胞周期和侵襲轉移情況。
　　實驗結果：1.初步篩選得到14個候選siRN

6、A靶區(qū)段,經(jīng)過同源序列檢索和進一步優(yōu)選,最終確定257-275位(GATCCAGTGGTGGTTTGAA)、943-961位(GGTCAGAGCTACACATTGA)和1203-1221位(GGGCAGCACCAGAATGACA)為靶序列區(qū)段。2.siRNA發(fā)卡DNA的退火后三個退火產(chǎn)物si257、si943和si1203,電泳可見三條明亮條帶,位于近100bp處,與設計一致。3.PstⅠ酶切篩選得到重組子pGeneClip-si257

7、、pGeneClip-si943和pGeneClip-si1203,測序分析其插入序列與設計完全一致。4.實驗組(pGeneClip-si257、pGeneClip-si943和pGeneClip-si1203)的EC9706細胞,CD147基因的mRNA表達水平明顯降低,與兩個對照組(空載體對照組和空白對照組)比較,差異有顯著性(P<0.05);其中pGeneClip-si1203的沉默抑制作用最強。5.空白對照組和空載體對照組在約為

8、60kD均有明顯印跡條帶,而3個實驗組的印跡條帶都明顯弱于空白對照組和空載體對照組;其中以實驗3組(轉染pGeneClip-si1203)的印跡條帶最淺。與熒光定量RT-PCR檢測結果一致。6.實驗1、2、3組、空載體對照組、空白對照組之間G0~G1期、G2~M期、S期比例及細胞增殖率的差異無顯著性(P>0.05)。7.兩個對照組(空載體對照組和空白對照組)MMP-9含量差異無顯著性(P>0.05):與3個實驗組比較差異均有顯著性(P>

9、0.05)。說明抑制食管癌EC9706細胞CD147的表達可抑制細胞MMP-9的產(chǎn)生。8.實驗1、2、3組細胞與空載體對照組、空白對照組相比穿透人工基底膜的細胞數(shù)明顯減少,異性有顯著差異(P<0.05)。實驗3組(轉染pGeneClip-si1203)的抑制穿透人工基底膜作用強于實驗2組和實驗1組。
　　結論：1.CD147基因1203-1221位(GGGCAGCACCAGAATGACA)是有效沉默表達的siRNA靶序列,構建的s