雷帕霉素及Mtor siRNA對(duì)食管癌EC9706細(xì)胞mTOR基因表達(dá)影響的研究.pdf

1、食管癌是我國(guó)最常見的惡性腫瘤之一,河南省林州市食管癌的發(fā)病率高達(dá)108.6/10萬(wàn)。食管癌侵襲性強(qiáng),進(jìn)展迅速且多伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,易復(fù)發(fā),預(yù)后差。常規(guī)手術(shù)治療及放、化療效果均不盡如意,所以,尋求治療食管癌的新方法為當(dāng)前研究熱點(diǎn)。
　　 哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶(mammalian target of rapamyein,mTOR)是一種非典型的絲氨酸/蘇氨酸(Ser/Thr)激酶,也是一種重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子,其基因定位于1p36.2,編

2、碼的蛋白質(zhì)由2,549個(gè)氨基酸組成,分子量為289kDa。mTOR能感受營(yíng)養(yǎng)、能量等信號(hào),在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖等細(xì)胞基本功能活動(dòng)中起著關(guān)鍵作用。研究表明,mTOR信號(hào)通路異常與乳腺癌、腎細(xì)胞癌,肺癌等腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。所以,mTOR已成為當(dāng)前腫瘤治療的新靶點(diǎn)。
　　 缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)是HIF-1的活性亞基,與腫瘤血管的生成密切相關(guān)。VEGF在腫瘤血管、淋

3、巴管生成的各個(gè)環(huán)節(jié)中均起著重要作用,VEGF-C是VEGF的一個(gè)亞型,不僅能促進(jìn)淋巴管的生成和擴(kuò)張,還可以增加血管的通透性。VEGF是HIF-1通路下游的一個(gè)靶基因,其表達(dá)受HIF-1α的調(diào)節(jié)。另有報(bào)道表明,在一些腫瘤中,mTOR與HIF-1α的表達(dá)呈正相關(guān)。
　　 雷帕霉素(Rapamycin,RAPA)是一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素,也是mTOR特異性抑制劑。雷帕霉素進(jìn)入細(xì)胞后能能與FKBP(FK506結(jié)合蛋白)結(jié)合形成復(fù)合物,該復(fù)

4、合物能抑制mTOR的表達(dá)。研究證實(shí),雷帕霉素不僅有較強(qiáng)的免疫抑制作用,還具有一定的抗腫瘤作用。
　　 RNA干擾(RNA interference,RNAi)是一種雙鏈RNA(double-stranded RNA,dsRNA)分子在mRNA水平沉默相應(yīng)序列基因的表達(dá)的過程,它通過21-23nt的dsRNA或發(fā)夾狀RNA(hort hair pin RNAs,shRNAs)與特異性mRNA結(jié)合導(dǎo)致靶基因的降解,進(jìn)而抑制目的基因的

5、表達(dá)。RNAi技術(shù)以其快速、高效、操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于基因功能的研究及疾病的基因治療。
　　 本研究用雷帕霉素及mTOR siRNA處理食管癌EC9706細(xì)胞,采用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞中mTOR及HIF-1α、VEGF、VEGF-C蛋白的表達(dá)；采用原位雜交技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞中mTOR mRNA的表達(dá)；采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)情況,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期的變化；采用流式細(xì)胞技術(shù)、TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率的變化。為分子靶向

6、治療食管癌提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。
　　 材料和方法：
　　 1.人食管癌EC9706細(xì)胞株由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院分子腫瘤學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。
　　 2.食管癌EC9706的培養(yǎng)。
　　 3.mTOR siRNA的體外合成、鑒定及篩選。
　　 4.人食管癌EC9706細(xì)胞復(fù)蘇、孵育、傳代分組。雷帕霉素單獨(dú)處理組:用100、150和200nM(低、中和高濃度)的雷帕霉素分別處理EC9706細(xì)胞24h、

7、48h、72h；mTOR siRNA(m.siRNA)單獨(dú)處理組:用50、100和150nM(低、中和高濃度)的mTOR siRNA分別轉(zhuǎn)染EC9706細(xì)胞24h、48h、72h；順鉑(DDP)單獨(dú)處理組(3mg/L)；聯(lián)合處理組:mTOR siRNA聯(lián)合雷帕霉素處理組(m.siRNA& RAPA,100nM的mTOR siRNA轉(zhuǎn)染24h后加200nM的雷帕霉素再作用24h),mTOR siRNA聯(lián)合順鉑處理組(m.siRNA& DD

8、P,100nM的mTOR siRNA轉(zhuǎn)染24h后加3mg/L的順鉑再作用24h)及雷帕霉素聯(lián)合順鉑處理組(RAPA& DDP,150nM的雷帕霉素、3mg/L的順鉑同時(shí)作用24h):同時(shí)設(shè)正常對(duì)照組(常規(guī)培養(yǎng)液),無(wú)關(guān)對(duì)照組(轉(zhuǎn)染無(wú)關(guān)siRNA序列)及溶劑對(duì)照組(DMSO)。
　　 5.采用免疫細(xì)胞化學(xué)PV法檢測(cè)各組EC9706細(xì)胞mTOR蛋白的表達(dá)情況,檢測(cè)各單獨(dú)處理組作用48h、各聯(lián)合處理組及相應(yīng)單獨(dú)處理組細(xì)胞HIF-1α、

9、VEGF及VEGF-C蛋白的表達(dá)情況。
　　 6.采用細(xì)胞原位雜交技術(shù)檢測(cè)各組EC9706細(xì)胞mTOR mRNA的表達(dá)情況。
　　 7.采用MTT法檢測(cè)各組對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的影響。
　　 8.采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)各單獨(dú)處理組作用48h、各聯(lián)合處理組及相應(yīng)單獨(dú)處理組細(xì)胞周期的變化。
　　 9.采用流式細(xì)胞技術(shù)及TUNEL法檢測(cè)各單獨(dú)處理組作用48h、各聯(lián)合處理組及相應(yīng)單獨(dú)處理組細(xì)胞凋亡的變化情況。
　

10、　 10.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:應(yīng)用SAS9.1.3統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。
　　 結(jié)果：
　　 1.細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變
　　 各對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)較一致,細(xì)胞均呈不規(guī)則多邊形,輪廓清晰。與各對(duì)照組細(xì)胞相比,雷帕霉素處理后,細(xì)胞變小變長(zhǎng),有的呈梭形,并出現(xiàn)漂浮細(xì)胞,細(xì)胞生長(zhǎng)變慢,這些變化隨著藥物濃度的增加、時(shí)間延長(zhǎng)更加明顯；轉(zhuǎn)染mTORsiRNA后的細(xì)胞發(fā)生皺縮,體積變小,細(xì)胞邊界模糊,間隙增寬,懸浮細(xì)胞增加,隨著轉(zhuǎn)染濃度的增加

11、和時(shí)間的延長(zhǎng),上述變化更加明顯；其余各組細(xì)胞形態(tài)也均有相應(yīng)得變化。
　　 2.免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果
　　 2.1各組細(xì)胞中mTOR蛋白的表達(dá)
　　 與各對(duì)照組相比,雷帕霉素(F=106.87、60.86、60.86,P均<0.0001)及mTOR siRNA(F=24.14、45.78、59.19,P均<0.0001)單獨(dú)處理組細(xì)胞中mTOR蛋白的表達(dá)均有所下降,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且均有濃度依賴性和時(shí)間依賴性(FR

12、APA=11.68、5.20、26.9,P=0.0002、0.0123、0.0001；Fm.sjRNA=50.22、42.23、29.46,P均<0.0001),順鉑單獨(dú)處理組細(xì)胞中mTOR蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化(P>0.05)；mTOR siRNA聯(lián)合雷帕霉素處理組(2.24±0.43)與正常對(duì)照組相比(7.04±1.21),細(xì)胞mTOR蛋白的表達(dá)均明顯減弱,且比各相應(yīng)單獨(dú)處理組(m.siRNA:3.97±0.48;RAPA:4.69±0

13、.45)減弱更明顯,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。
　　 2.2各組細(xì)胞中HIF-1α、VEGF及VEGF-C蛋白的表達(dá)
　　 與各對(duì)照組相比,各處理組細(xì)胞中HIF-1α(FRAPA=4740.81,P<0.001;Fm.siRNA=2072.36,P<0.001)、VEGF(FRAPA=2498.45,P<0.001；Fm.siRNA=2202.21,P<0.001)及VEGF-C(FRAPA=5321.03,

14、P<0.001；Fm.siRNA=24770.37,P<0.001)蛋白均明顯減弱,且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,各聯(lián)合處理組與相應(yīng)單獨(dú)處理組相比,HIF-1α(RNA& RAPA vs m.siRNA、RAPA:2.00±0.02 vs3.12±0.04、3.26±0.06)、VEGF(m.siRNA& DDP vs m.siRNA、DDP:1.99±0.03 vs3.12±0.04、4.24±0.01)、及VEGF-C(RAPA& DDP

15、vs RAPA、DDP:2.91±0.03 vs3.12±0.04、4.24±0.01)蛋白的表達(dá)均減弱,且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.001)；Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示,EC9706細(xì)胞HIF-1α(r=0.93,P<0.05)、VEGF(r=0.95,P<0.05)及VEGF-C(r=0.94,P<0.05)的表達(dá)與mTOR的表達(dá)均呈顯著正相關(guān)。
　　 3.原位雜交結(jié)果
　　 各組細(xì)胞中mTOR mRNA

16、的表達(dá)情況與mTOR蛋白的表達(dá)一致。
　　 4.各組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的比較
　　 與各對(duì)照組相比,各處理因素對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)均有明顯的抑制作用(P均<0.001),各對(duì)照組之間細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率無(wú)明顯差異(P均>0.05)；mTOR siRNA轉(zhuǎn)染組中,隨轉(zhuǎn)染濃度的增加(F=78.77、76.14、52.25,P均<0.001),轉(zhuǎn)染時(shí)間的延長(zhǎng)(F=143.48、172.98、155.01,P均<0.001),對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作

17、用增強(qiáng),且不同濃度及不同時(shí)間段各組兩兩相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；雷帕霉素處理組中,同一時(shí)間段,隨著雷帕霉素濃度(F=36.36、49.94、33.50,P均<0.0001)的增加,對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率明顯增加,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05),同一濃度的雷帕霉素,隨著作用時(shí)間(F=103.64、186.30、151.78,P均<0.0001)的延長(zhǎng),對(duì)細(xì)胞的抑制率也明顯增加,且差異也均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；

18、各聯(lián)合處理組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(m.siRNA& RAPA:33.15±0.03;m.siRNA&DDP:45.48±0.09；RAPA&DDP:27.30±0.11)明顯高與相應(yīng)各單獨(dú)處理組(m.siRNA:27.30±3.76；RAPA:8.26±0.27；DDP:21.34±2.26),且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。
　　 5.流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞增殖情況
　　 與各對(duì)照相比(G0/G1:53.11±0.61

19、、52.87±0.85、53.27±0.90、53.45±0.85；S:18.85±0.89、19.37±1.03、18.85±0.89、18.55±1.44、18.57±1.14),各組各期細(xì)胞數(shù)所占的比例有所不同,G0/G1期的細(xì)胞的比例增加,S期的細(xì)胞比例減少,差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；mTOR siRNA轉(zhuǎn)染組中,隨轉(zhuǎn)染濃度的增加,G0/G0期細(xì)胞的比例增加(64.95±1.53,67.53±1.25,72.16±1

20、.58),S期的細(xì)胞比例減少(20.03±1.27,18.48±1.48,14.38±1.59),且三個(gè)濃度之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；雷帕霉素處理組中,G0/G1期細(xì)胞所占的比例隨雷帕霉素的濃度增加而增加(64.81±1.46,66.69±0.87,73.52±1.48),S期的細(xì)胞比例隨之減少(19.93±1.48,19.26±0.98,12.36±1.92),三個(gè)濃度兩兩之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；各

21、聯(lián)合處理組(m.siRNA&RAPA:82.89±0.76;m.siRNA& DDP:82.89±0.76；RAPA& DDP:71.71±0.56)中,G0/G1期細(xì)胞所占的比例高于各相應(yīng)單獨(dú)處理組(m.siRNA:15.16±1.68；RAPA:17.55±0.57；DDP:17.19±1.06),且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。
　　 6.TUNEL及流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況
　　 兩種方法結(jié)果均顯示

22、,與各對(duì)照組相比(AI:1.92±0.15、1.87±0.15、0.89±0.17及2.28±0.15％；早期凋亡細(xì)胞:5.46±1.79、4.07±2.08、4.99±2.24及4.34±1.24％),雷帕霉素、mTOR siRNA各單獨(dú)處理組細(xì)胞AI(RAPA:9.40±0.69、22.56±0.99、30.58±1.84；m.siRNA:10.17±0.51、10.17±0.51、35.35±1.48)及早期凋亡細(xì)胞率(4.82±

23、1.15、14.07±1.15、29.76+2.89)、晚期凋亡率(14.81±1.50、24.13±3.02、30.11±7.00)均明顯增加,且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。AI及凋亡率隨濃度增加而增加,各濃度之間及間兩兩相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；各聯(lián)合處理組中,細(xì)胞AI(m.siRNA& RAPA:26.5±10.16％:m.siRNA&DDP:39.78±0.14％；RAPA&DDP:40.02±0.1

24、4％)、早期凋亡率(m.siRNA& RAPA:26.69±0.41％；m.siRNA& DDP:28.88±0.44％；RAPA& DDP:19.09±1.29％及晚期凋亡率(m.siRNA& RAPA:28.28±0.59％；m.siRNA& DDP:29.33±0.54％；RAPA& DDP:26.13±1.91％)均高于各相應(yīng)單獨(dú)處理組細(xì)胞AI(RAPA:14.95±0.84,m.siRNA:22.56±0.99,DDP:26.

25、96±4.12)、早期凋亡率(RAPA:19.09±1.29,m.siRNA:14.90±2.74,DDP:15.16±1.38)及晚期凋亡率(RAPA:15.83±1.74,m.siRNA:21.10±3.59,DDP:17.90±1.40),且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.雷帕霉素、mTOR siRNA可特異性抑制食管癌EC9706細(xì)胞mTOR蛋白及mRNA的表達(dá),同時(shí)下調(diào)HIF-1