禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒轉(zhuǎn)錄組學(xué)及免疫抑制機(jī)理的研究.pdf

1、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒轉(zhuǎn)錄組學(xué)及免疫抑制機(jī)理的研究Transcriptomicsandimmunosuppressionmechanismofreticuloendotheliosisvirusinfection研究生：繆佶導(dǎo)師：秦愛建教授專業(yè)：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)資助項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(31101814)國家自然科學(xué)基金(31201881)教育部創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(IRT0978)江蘇省優(yōu)勢(shì)學(xué)科項(xiàng)[|(PAPD)江蘇省普通高校研究生科研創(chuàng)新計(jì)劃CX

2、LX1433江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心項(xiàng)目揚(yáng)州大學(xué)2016年6月2揚(yáng)州大學(xué)博士學(xué)位論文2REV感染宿主細(xì)胞CEF的轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究本研究旨在了解該病毒與宿主之間的相互作用關(guān)系，利用基因表達(dá)譜芯片技術(shù)以及熒光PCR方法，在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)病毒感染宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行監(jiān)測(cè)。結(jié)果表明，病毒感染ld、3d、5d以及7d四個(gè)時(shí)間點(diǎn)共鑒定出1785個(gè)差異表達(dá)基因，其中參與免疫反應(yīng)的相關(guān)基因在病毒感染后期呈現(xiàn)顯著的差異性變化。進(jìn)一步分

3、析發(fā)現(xiàn)，差異基因主要參與信號(hào)傳導(dǎo)、免疫反應(yīng)、自噬作用以及細(xì)胞粘附作用等，其中相關(guān)信號(hào)通路有MAPK信號(hào)通路、JAK／STAT信號(hào)通路以及Toll樣受體信號(hào)通路等。在眾多差異基因中，IL6、STAT1、Myd88、TLRs、NFrd3、IRFs以及ISGs等在病毒感染過程中可能發(fā)揮著更為重要的作用，但其相關(guān)機(jī)制還需進(jìn)一步研究。本研究首次對(duì)REV感染宿主的轉(zhuǎn)錄組學(xué)進(jìn)行研究，從而為該病毒的致病機(jī)理以及先天免疫途徑等奠定了基礎(chǔ)。3不同細(xì)胞中RE

4、V增殖效力研究REV的流行病學(xué)以及分子生物學(xué)研究己取得了一定的進(jìn)展，但是目前用于REV的細(xì)胞培養(yǎng)體系只限于雞成纖維細(xì)胞，而REV的靶向?yàn)槊庖邔?shí)質(zhì)器官，這就限制了對(duì)REV的深刻認(rèn)識(shí)。本研究選取雞成纖維細(xì)胞系DFl、雞巨噬細(xì)胞系HDl1、雞T淋巴細(xì)胞系MSBl以及雞B淋巴細(xì)胞系進(jìn)行病毒感染實(shí)驗(yàn)。通過建立的RealtimePCR方法對(duì)病毒感染水平檢測(cè)。研究發(fā)現(xiàn)，感染后REV拷貝數(shù)在不同的細(xì)胞系中均呈現(xiàn)漸進(jìn)增加趨勢(shì)：病毒在成纖維細(xì)胞系中的復(fù)制效

5、率區(qū)別于免疫細(xì)胞系中的復(fù)制效率。間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)可觀察到病毒感染DFl細(xì)胞后在96h可見明顯陽性反應(yīng)，而HDl1、MSBl、DT40這三種免疫細(xì)胞系在48h前均可見陽性反應(yīng)。此外，顯微鏡下觀察免疫細(xì)胞系與成纖維細(xì)胞系在形態(tài)學(xué)上存在一定區(qū)別，主要反應(yīng)在免疫細(xì)胞在感染后期出現(xiàn)細(xì)胞碎片增多，細(xì)胞密度降低、體積縮小、折光性減弱等現(xiàn)象。本研究首次進(jìn)行REV體外感染免疫細(xì)胞，提供了相應(yīng)的感染條件和規(guī)律，為進(jìn)一步研究和完善相關(guān)機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。4REV

6、感染引起免疫細(xì)胞凋亡的機(jī)理研究REV感染引起宿主細(xì)胞凋亡并造成免疫器官的實(shí)質(zhì)性損傷，該損傷與免疫細(xì)胞的凋亡有關(guān)。本研究利用REV分別感染DFl細(xì)胞、HDll細(xì)胞、MSBl細(xì)胞、以及DT40細(xì)胞等不同細(xì)胞系后，利用CCK8法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)活力，然后通過TUNEL熒光染色法和AnnexinV／PI流式細(xì)胞術(shù)觀察REV對(duì)免疫細(xì)胞的凋亡影響，并利用RealtimePCR檢測(cè)凋亡相關(guān)信號(hào)分子Caspase3、8、9的表達(dá)，結(jié)果顯示，REV感染后的免