宿主波形蛋白在禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒感染中的作用機(jī)制研究.pdf

1、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病(Reticuloendotheliosis，RE)是嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)的傳染性腫瘤病之一，也是重要的免疫抑制病。禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒(Reticuloendotheliosisvirus，REV)感染主要造成網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞增生，誘發(fā)機(jī)體免疫抑制和矮小綜合征等，同時(shí)REV能污染馬立克氏病病毒疫苗、禽痘病毒疫苗等生物制品，從而降低疫苗的免疫效果。目前，REV常和馬立克氏病病毒、白血病病毒、傳染性貧血病病毒、傳染性法氏囊病

2、病毒等禽的免疫抑制性病毒混合感染，使疾病的發(fā)生更為嚴(yán)重，且有加重趨勢。隨著我國養(yǎng)殖業(yè)的集約化發(fā)展，REV感染造成的損失已經(jīng)嚴(yán)重影響了養(yǎng)禽業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益，所以，有必要對REV感染及致病機(jī)制進(jìn)行深入研究。
　　目前，對REV的研究主要局限在基因組的插入整合、混合感染、疫苗污染等方面，但病毒編碼蛋白的功能及其在感染和致病過程中與宿主蛋白之間相互作用等方面的研究鮮有報(bào)道，有待于開展。病毒與宿主相互作用在病毒感染過程中發(fā)揮重要作用，研究REV

3、與宿主相互作用有助于了解病毒的復(fù)制機(jī)制。在本實(shí)驗(yàn)室的前期研究中，采用蛋白質(zhì)組學(xué)方法并結(jié)合雙向電泳技術(shù)，獲得了REV感染SPF雞的脾臟差異蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)，經(jīng)過質(zhì)譜分析成功鑒定出包括波形蛋白(vimentin)在內(nèi)的28種差異表達(dá)蛋白。研究報(bào)道，宿主vimentin在多種病毒的感染過程中發(fā)揮重要作用。本研究旨在探討vimentin在REV感染中的作用。
　　本研究首先利用建立的檢測vimentin基因的Real time PCR方法檢測v

4、imentin基因在不同組織臟器中的分布，結(jié)果表明vimentin蛋白廣泛表達(dá)于所檢測的各組織臟器中，其中胸腺、法氏囊和脾臟含量最高。同時(shí)檢測發(fā)現(xiàn)，REV感染后導(dǎo)致易感細(xì)胞CEF和主要靶器官脾臟中vimentin上調(diào)表達(dá)。利用靶向vimentin蛋白的特異性RNAi分子沉默CEF細(xì)胞內(nèi)源性vimentin蛋白的表達(dá)，可抑制REV基因組的復(fù)制、蛋白的表達(dá)以及REV的增殖。利用能特異性破壞vimentin蛋白結(jié)構(gòu)的藥物丙烯酰胺處理REV易感

5、細(xì)胞CEF，同樣可抑制REV基因組的復(fù)制、蛋白的表達(dá)以及REV的增殖。這說明，宿主細(xì)胞vimentin有利于REV的復(fù)制。
　　為進(jìn)一步探索宿主vimentin影響REV復(fù)制的機(jī)制，本研究首先通過密碼子優(yōu)化和蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化，對REV蛋白酶(protease，PR)進(jìn)行了可溶性表達(dá)。以表達(dá)的REV自身蛋白p18-p30為底物，對其酶活性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示可溶性表達(dá)的PR蛋白具有良好的蛋白酶活性，能有效切割底物p18-p30，并且

6、PR活性的發(fā)揮受溫度、pH值、離子等因素的影響。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)PR蛋白對原核和真核表達(dá)的vimentin蛋白均具有切割作用，將PR蛋白截短表達(dá)以及將其活性中心DTG基序突變?yōu)镈SG后，結(jié)果顯示PR均不能有效切割vimentin，這表明PR的這種切割作用依賴于其蛋白分子結(jié)構(gòu)和活性中心DTG基序。將表達(dá)PR蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒pCAGGS-PR轉(zhuǎn)染細(xì)胞，真核表達(dá)的PR蛋白對細(xì)胞內(nèi)源性vimentin蛋白同樣具有切割作用。激光共聚焦試驗(yàn)結(jié)果顯示

7、，真核表達(dá)PR蛋白能夠?qū)е录?xì)胞中的vimentin在細(xì)胞核周圍發(fā)生聚集，同樣的REV感染后也能改變vimentin在宿主細(xì)胞內(nèi)的分布，在細(xì)胞核周圍發(fā)生聚集，且與REV結(jié)構(gòu)蛋白共定位。
　　綜上，REV感染導(dǎo)致宿主vimentin上調(diào)表達(dá);宿主vimentin有利于REV的復(fù)制;REVPR在體內(nèi)外具有切割宿主vimentin的作用，而且這種切割作用依賴于PR蛋白的分子結(jié)構(gòu)和活性中心DTG基序;REV感染后通過PR與宿主的互作而改變v