SIRT1通過抑制p66shc改善高血糖導致的內(nèi)皮細胞功能失常及預防血管衰老的發(fā)生.pdf

1、由于糖尿病的患病人數(shù)急速增加，糖尿病及并發(fā)癥已成為十分嚴峻的公共衛(wèi)生問題。糖尿病導致的心血管并發(fā)癥是糖尿病致死致殘的最主要原因。作為血管屏障的內(nèi)皮細胞對血管功能起著極其重要的調(diào)節(jié)作用，高血糖通過氧化應激造成的內(nèi)皮細胞功能失常及血管衰老是糖尿病血管并發(fā)癥的主要發(fā)病原因之一。因此，對高血糖情況下內(nèi)皮細胞功能失常及血管衰老的研究，為糖尿病心血管并發(fā)癥的防治提供了方向。
　　 SIRT1是哺乳動物中依賴于NAD+的Ⅲ類組蛋白去乙?；?，

2、是低等動物中Sir2的同源物，在許多生命過程，如細胞周期、細胞凋亡、DNA損傷修復、長壽和基因沉默中都發(fā)揮了重要的作用。SIRT1能夠去乙酰化FOXO并且促進它的活性，因此具有抗氧化應激的能力。雖然大量研究認為SIRT1介導了能量限制(CR)的長壽效應，但SIRT1在細胞衰老中的作用卻存在爭議，而SIRT1在組織衰老中的作用還沒有報道。p66shc是介導氧化應激和凋亡的重要分子，p66shc-/-鼠不僅氧化應激水平降低，壽命明顯延長，還

3、能抵御高血糖引起的內(nèi)皮細胞功能失常；p66shc-/-鼠的心肌祖細胞(CPC)能抵抗高糖引起的細胞衰老。因此我們推測：在內(nèi)皮細胞過表達SIRT1可以保護內(nèi)皮細胞，抵御高血糖引發(fā)的氧化應激導致的內(nèi)皮細胞功能失常，防止血管衰老的發(fā)生，其機制可能與p66shc相關(guān)。
　　 首先，我們檢測了正常和患有糖尿病的C57鼠以及2個月和18個月的C57小鼠主動脈中SIRT1的表達水平，發(fā)現(xiàn)糖尿病及衰老時小鼠主動脈中SIRT1的表達水平顯著降低；

4、為了研究SIRT1在糖尿病血管損傷中的作用，選用實驗室己建立的SIRT1內(nèi)皮特異的轉(zhuǎn)基因小鼠（陽性鼠和陰性鼠），通過腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)的方法建立了工型糖尿病模型。注射STZ2個月后，血管環(huán)張力實驗證明SIRT1過表達改善了糖尿病導致的內(nèi)皮功能失常，免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)SIRT1過表達抑制了糖尿病導致的8-OH-dG和nitrotyrosine水平的升高，降低了血管的氧化應激水平；取患有2個月糖尿病的小鼠的主動脈，用Western

5、blotting檢測發(fā)現(xiàn)SIRT1過表達能降低p66shc的蛋白表達水平，升高抗氧化應激分子MnSOD水平，但對p53、p21和PAI-1等衰老標志的水平無顯著影響，說明這個階段SIRT1主要是改善內(nèi)皮功能失常。進而我們在細胞水平探討了SIRT1調(diào)節(jié)p66shc的機制。在人原代內(nèi)皮細胞中過表達SIRT1能降低高糖誘導的p66shc的mRNA和蛋白的表達。ChIP證實SIRT1結(jié)合p66shc的promoter上（-276bp至-535b

6、p），過表達SIRT1可以降低p66shc的promoter組蛋白H3的乙?；健Ａ硗?，我們發(fā)現(xiàn)在患有工型糖尿病模型小鼠主動脈中，SIRT1轉(zhuǎn)基因鼠與野生型鼠相比，H3的乙酰化水平也顯著降低。能量限制12個月的模型小鼠主動脈中SIRT1水平升高，p66shc表達水平降低，進一步證明SIRT1能降低p66shc的表達，提示SIRT1能防止血管衰老。接著我們在HUVECs中通過SA-β-gal染色發(fā)現(xiàn)過表達SIRT1對高糖刺激引起的人原代

7、內(nèi)皮細胞衰老有保護作用，而抑制SIRT1能促進高糖刺激引起的人原代內(nèi)皮細胞衰老。由此我們將工型糖尿病模型造模時間延長到了10個月。Ⅰ型糖尿病模型小鼠10個月時，主動脈中SIRT1過表達能降低p66shc的水平，同時降低p53、p21和PAI-1等衰老標志的表達水平，這說明SIRT1可能通過抑制p66shc表達，改善內(nèi)皮功能失常，進而防止血管衰老的發(fā)生。最后，我們在18個月的轉(zhuǎn)基因小鼠主動脈中檢測了p66shc和衰老相關(guān)分子的的蛋白表達變

8、化。我們發(fā)現(xiàn)：18個月大的SIRT1轉(zhuǎn)基因鼠與野生型鼠相比，SIRT1轉(zhuǎn)基因鼠主動脈中p66shc顯著降低，同時也發(fā)現(xiàn)p53、p21和PAI-1等衰老相關(guān)分子的蛋白水平顯著降低，進一步為證實SIRT1能降低p66shc的表達，防止血管衰老提供證據(jù)，還提示SIRT1可以抑制年齡依賴的動脈衰老。
　　 結(jié)論：我們首次發(fā)現(xiàn)p66shc是SIRT1的一個新的下游分子，SIRT1與p66shc的啟動子結(jié)合，通過去乙?；M蛋白H3而下調(diào)p6

9、6shc的表達水平；在內(nèi)皮細胞中，SIRT1可能通過降低p66shc的表達水平，對氧化應激引起的內(nèi)皮細胞衰老起到了保護作用；在工型糖尿病模型中，SIRT1內(nèi)皮細胞特異的轉(zhuǎn)基因可能通過降低p66shc的表達，降低了血管的氧化應激水平，改善了內(nèi)皮細胞的功能，預防動脈衰老的發(fā)生，并且SIRT1還抑制年齡依賴的動脈衰老。
　　 心臟病專家和絕大多數(shù)內(nèi)科醫(yī)生認為衰老是人類患動脈粥樣硬化的一個獨立危險因數(shù)，因此動脈粥樣硬化常被看作人類衰老的

10、重要特征。最近應用多種動物模型進行的基因分析證實有一些分子對于衰老是至關(guān)重要的。這些分子包括參與DNA損傷修復，腫瘤抑制，端粒維護，insulin/AKT通路以及其他代謝途徑的分子，其中絕大多數(shù)的分子不僅可以影響機體衰老的表型，還可以直接調(diào)節(jié)細胞的衰老，提示細胞衰老與機體衰老間存在因果聯(lián)系。例如，DNA修復功能缺陷可引起類似早衰的表型，在衰老細胞中更容易出現(xiàn)DNA損傷的累積；過多的能量攝入能引起糖尿病和高胰島素血癥，而體外實驗表明胰島素