轉(zhuǎn)染IL-17基因?qū)π∈笪赴┘?xì)胞生物學(xué)特性的影響及其促腫瘤機制研究.pdf

1、目的:IL-17是一種主要由活化的人記憶CD4+T細(xì)胞分泌的促炎細(xì)胞因子，在固有免疫和適應(yīng)性免疫中發(fā)揮作用，參與細(xì)胞的增殖分化、生物因子的轉(zhuǎn)錄與表達、機體的免疫調(diào)節(jié)及腫瘤生長。本研究采用IL-17真核表達載體pcDNA3.1-IL-17轉(zhuǎn)染小鼠胃癌細(xì)胞株MFC，過表達IL-17，觀察IL-17過表達后對MFC細(xì)胞體外生長及其它生物學(xué)性狀的影響，進一步通過建立荷瘤小鼠動物模型觀察IL-17過表達后MFC細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的成瘤效應(yīng)，并分析其分

2、子改變，以期探討Th17/IL-17在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制。
　　方法:
　　1將IL-17真核表達載體pcDNA3.1-IL-17轉(zhuǎn)染小鼠胃癌細(xì)胞株MFC，同時將pcDNA3.1空載體轉(zhuǎn)染MFC細(xì)胞作為對照組細(xì)胞，經(jīng)G418篩選后獲得穩(wěn)定表達IL-17的陽性細(xì)胞克隆(MFC/IL-17)。
　　2倒置顯微鏡下觀察MFC、MFC/pcDNA3.1及MFC/IL-17細(xì)胞的形態(tài)變化，RT-PCR檢測IL-17基因表達

3、，ELISA法檢測細(xì)胞分泌IL-17的能力。
　　3 MTT法測定轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞的體外增殖反應(yīng)并繪制生長曲線。流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率的變化。
　　4 RT-PCR法檢測轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞內(nèi)趨化因子CCR6、CCL20、CXCL2和免疫調(diào)節(jié)因子VEGF、MMP-9、IL-6的表達變化。
　　5分別以MFC、MFC/pcDNA3.1和MFC/IL-17細(xì)胞接種615小鼠，建立荷瘤小鼠動物模型，觀察小鼠成瘤及皮下腫瘤生長情況。<

4、br>　　6接種腫瘤細(xì)胞3周后處死小鼠，RT-PCR法檢測腫瘤組織內(nèi)IL-17、VEGF和Podoplanin mRNA表達。Western-blot法檢測腫瘤組織內(nèi)IL-17、VEGF和Podoplanin的蛋白表達。免疫組化法檢測腫瘤組織內(nèi)微血管的形成情況。
　　結(jié)果:
　　1將IL-17基因轉(zhuǎn)染小鼠胃癌MFC細(xì)胞，建立MFC/IL-17細(xì)胞株。光學(xué)顯微鏡下觀察MFC、MFC/pcDNA3.1和MFC/IL-17細(xì)胞無明

5、顯形態(tài)學(xué)變化;RT-PCR實驗結(jié)果顯示，MFC/IL-17細(xì)胞能表達IL-17基因，而MFC和MFC/pcDNA3.1細(xì)胞無IL-17基因表達。ELISA實驗結(jié)果顯示，與MFC和MFC/pcDNA3.1細(xì)胞相比，MFC/IL-17細(xì)胞分泌IL-17能力明顯增強(P＜0.05)。
　　2 MTT實驗結(jié)果顯示，MFC、MFC/pcDNA3.1和MFC/IL-17細(xì)胞的體外增殖活性無明顯差異(P＞0.05)。流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示，三組細(xì)

6、胞凋亡率無顯著差異（P＞0.05）。上述結(jié)果提示，轉(zhuǎn)染IL-17基因?qū)FC細(xì)胞的體外增殖和凋亡無顯著影響。
　　3 RT-PCR實驗結(jié)果顯示，與MFC和MFC/pcDNA3.1細(xì)胞相比，MFC/IL-17細(xì)胞內(nèi)趨化因子CCR6、CCL20、CXCL2和免疫調(diào)節(jié)因子VEGF、MMP-9、IL-6 mRNA表達水平均顯著增高（P＜0.05）。
　　4將MFC、MFC/pcDNA3.1和MFC/IL-17細(xì)胞接種615小鼠后，三

7、組小鼠皮下均有腫瘤結(jié)節(jié)形成，但是，MFC/IL-17組小鼠的腫瘤生長速度及腫瘤質(zhì)量均顯著大于MFC和MFC/pcDNA3.1組(P＜0.05)。
　　5取三組小鼠腫瘤組織，分別用RT-PCR和Western-blot方法檢測IL-17、VEGF和Podoplanin基因和蛋白表達，結(jié)果顯示，與MFC和MFC/pcDNA3.1組相比，MFC/IL-17組小鼠腫瘤組織內(nèi)IL-17、VEGF和Podoplanin mRNA和蛋白表達水平

8、均顯著增高（P＜0.05）。
　　6免疫組化實驗結(jié)果顯示，與MFC和MFC/pcDNA3.1組相比MFC/IL-17組小鼠腫瘤組織內(nèi)CD31陽性細(xì)胞顯著增多，微血管密度明顯增加(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1轉(zhuǎn)染IL-17基因?qū)π∈笪赴┘?xì)胞MFC的體外增殖活性和細(xì)胞凋亡率無明顯影響，但可上調(diào)細(xì)胞內(nèi)趨化因子CCR6、CCL20、CXCL2及免疫調(diào)節(jié)因子VEGF、MMP-9、IL-6的基因表達。
　　2將MFC