芹菜素對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)活性的影響及機(jī)制研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌(Primary hepat ic careinoma,PHC)是發(fā)生于肝細(xì)胞與肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞的癌變,以肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)最常見(jiàn),在我國(guó)惡性腫瘤死亡率居第二位。臨床上的治療一般視手術(shù)、放療、化療為三大支柱,雖然手術(shù)切除的療效是最好的,但是接受診治的HCC患者絕大多數(shù)已屬中晚期,失去手術(shù)時(shí)機(jī)。同時(shí)化療及放療療效不佳,且有一定的禁忌。因此研發(fā)新的天然、低毒、高效的臨床抗HCC藥物

2、以及尋找新的抗HCC分子靶點(diǎn)成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。
　　 芹菜素(apigenin)是天然存在的一種黃酮類化合物,廣泛存在于多種水果、蔬菜(包括芹菜)、豆類、橘子、茶葉、小麥牙和一些調(diào)味品中。研究表明,芹菜素可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和凋亡而抑制多種惡性腫瘤(食管癌、胰腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌等)細(xì)胞的生長(zhǎng),并且具有天然、低毒、高效的特點(diǎn)。最新的研究表明,芹菜素通過(guò)誘導(dǎo)凋亡及誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯于G2/M期而抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng),但對(duì)于其具體的

3、分子機(jī)制仍不是很清楚。
　　 本課題的總體研究思路為:選擇肝癌細(xì)胞株Huh-7作為研究對(duì)象,首先通過(guò)四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞儀(FACS)以及裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)芹菜素的抗HCC活性；然后進(jìn)一步通過(guò)人全基因組cDNA芯片技術(shù)分析芹菜素作用前后差異表達(dá)的基因；最后再通過(guò)qRT-PCR、Western-blot技術(shù)選擇性驗(yàn)證芯片分析結(jié)果,將為進(jìn)一步探討芹菜素對(duì)Huh-7細(xì)胞毒性的具體分子機(jī)制提供理論依據(jù)

4、。
　　 第一部分芹菜素在體內(nèi)及體外對(duì)肝細(xì)胞癌Huh-7生長(zhǎng)的抑制作用
　　 目的:
　　 1、研究芹菜素在體外對(duì)Huh-7細(xì)胞生物學(xué)活性的影響(細(xì)胞增殖、細(xì)胞克隆形成,細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡)。
　　 2、研究芹菜素在體內(nèi)對(duì)肝細(xì)胞癌Huh-7移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用。
　　 方法：
　　 1、MTT法繪制生長(zhǎng)曲線,觀察不同濃度芹菜素對(duì)Huh-7細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。
　　 2、通過(guò)平板克隆形成

5、實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度芹菜素對(duì)Huh-7細(xì)胞克隆形成能力的影響。
　　 3、采用PI染色法,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度芹菜素對(duì)Huh-7細(xì)胞周期分布的影響。
　　 4、采用Annexin V-FITC/PI染色法,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度芹菜素對(duì)Huh-7細(xì)胞凋亡狀態(tài)的影響。
　　 5、通過(guò)動(dòng)物模型觀察芹菜素對(duì)裸鼠人Huh-7移植瘤腫瘤體積的影響并通過(guò)HE染色在顯微鏡下觀察其病理學(xué)變化。
　　 結(jié)果：
　　

6、1、從生長(zhǎng)曲線可以看出,芹菜素對(duì)Huh-7細(xì)胞的生長(zhǎng)有顯著的抑制作用,并隨著藥物濃度的增加,其抑制作用顯著增強(qiáng),各組間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 2、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示:不論從克隆的大小還是克隆的數(shù)目,芹菜素處理組均較對(duì)照組明顯下降,差異具有顯著性(P<0.001)。
　　 3、芹菜素處理Huh-7細(xì)胞后細(xì)胞周期分布發(fā)生改變,主要表現(xiàn)在G2/M期細(xì)胞增加、G0/G1期細(xì)胞減少,細(xì)胞周期阻滯于G2/M期

7、,隨著藥物濃度的增加,這種周期阻滯作用越顯著,各組間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 4、凋亡檢測(cè)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)芹菜素可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,并呈劑量依賴性,各組間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 5、芹菜素處理的裸鼠腫瘤體積較未用芹菜素處理組明顯縮小(P<0.05),HE染色可見(jiàn)芹菜素處理組裸鼠腫瘤組織明顯的壞死。
　　 結(jié)論：
　　 芹菜素通過(guò)阻滯細(xì)胞周期于G2/M期、降低G0/G1期細(xì)胞比

8、例以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而抑制體內(nèi)體外肝細(xì)胞癌Huh-7的生長(zhǎng)。
　　 第二部分芹菜素抑制肝細(xì)胞癌Huh-7作用的分子機(jī)制研究
　　 目的:初步探討芹菜素抑制肝細(xì)胞癌Huh-7作用的分子機(jī)制。
　　 方法：
　　 1、通過(guò)人全基因組cDNA芯片技術(shù)分析芹菜素作用前后Huh-7細(xì)胞基因表達(dá)差異。
　　 2、采用qRT-PCR、Western-blot技術(shù)選擇性驗(yàn)證基因芯片結(jié)果。
　　 結(jié)果：

9、>　　 在41000個(gè)基因中,1764個(gè)基因的表達(dá)發(fā)生改變。其中1336個(gè)基因顯示上調(diào)(≥2倍),428個(gè)基因顯示下調(diào)表達(dá)(≤0.5)。在這些差異表達(dá)的基因中,大多數(shù)與核酸結(jié)合、轉(zhuǎn)運(yùn)、接觸和酶調(diào)節(jié)活性、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)和粘附、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、代謝、凋亡以及免疫反應(yīng)等相關(guān)。其中代謝相關(guān)基因SLC27A3上調(diào)27.69倍,轉(zhuǎn)錄相關(guān)基因OVOL1上調(diào)6.23倍,OTP基因上調(diào)5.53倍,抑癌基因ZDHHC2上調(diào)5.10倍,細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基

10、因BMPR1A上調(diào)5.09倍,免疫反應(yīng)相關(guān)基因IL-4R下調(diào)了81.1％,泛素依賴性蛋白分解代謝相關(guān)基因USP18下調(diào)了80.4％。qRT-PCR、Western-blot選擇性驗(yàn)證結(jié)果與芯片結(jié)果相符。進(jìn)一步分析細(xì)胞周期及凋亡相關(guān)功能性基因的表達(dá)差異,我們發(fā)現(xiàn)芹菜素上調(diào)了部分抑制細(xì)胞周期進(jìn)程的基因,同時(shí)也下調(diào)了部分促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程的基因。其總體作用趨勢(shì)為抑制細(xì)胞周期進(jìn)程。
　　 結(jié)論：
　　 芹菜素可能通過(guò)調(diào)節(jié)多種基因如