髓系白血病的分子遺傳學研究.pdf

1、本論文包括二部分：（一）急性早幼粒細胞白血病的分子遺傳學研究；（二）兩例非典型慢性髓細胞白血病的臨床及實驗室特征研究。
　　第一部分:急性早幼粒細胞白血病的分子遺傳學研究
　　目的：分析急性早幼粒細胞白血病（APL）中多種常見白血病基因的突變情況，初步探討這些基因突變是否協(xié)同參與急性早幼粒細胞白血病的發(fā)病機制及其與 APL病人的臨床表現(xiàn)、細胞遺傳學和分子危險度分層的關系。
　　方法：病例來源于2005-2010年期間在

2、蘇州大學附屬第一醫(yī)院住院診斷和治療的急性早幼粒細胞白血病84例，采用患者的骨髓標本提取基因組DNA，再以PCR方法擴增目標DNA，直接進行DNA測序，分析FLT3-ITD、WT1、FLT3-TKD、TET2、N-RAS、ASXL1、EZH2、MLL-PTD、IDH1、CBL、JAK1、DNMT3、c-Kit、NPM1、IDH2、RUNX1及JAK2(V617F)等基因突變在AML中的作用。
　　結果：
　　1.在84例初治A

3、PL患者中，有23例FLT3-ITD突變陽性（27.4%），F(xiàn)LT3-ITD均為框內雜合突變，重復片段長短不一；12例WT1突變陽性（14.3%），9例FLT3-TKD突變陽性（10.7%），7例TET2突變陽性（8.3%），5例N-RAS突變陽性（6.0%），4例ASXL1突變陽性（4.8%），2例EZH2突變陽性（2.4%），MLL-PTD、IDH1及CBL各1例陽性突變（1.2%）；而JAK1、DNMT3、c-Kit、NPM1、I

4、DH2、RUNX1、JAK2(V617F)等常見白血病相關基因在樣品中未發(fā)現(xiàn)突變。84例APL患者發(fā)生基因突變的患者總計51例，突變率為60.7%。
　　2. FLT3-ITD突變陽性患者較野生型患者相比，明顯具有高白細胞計數(shù)特點（WBC=24.3×109/L VS WBC=7.2×109/L），且差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.004）；而在中位年齡、血小板、血紅蛋白及原始細胞百分比等方面，與野生型患者無明顯差別（P>0.05）。N

5、-RAS突變陽性患者具有低血小板計數(shù)的特點（PLT=70.0×109/L VS PLT=21.5×109/L），且與野生型患者相比，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.012）；突變陽性患者的中位年齡明顯偏大，但統(tǒng)計學無明顯差異（P>0.05）；而白細胞、血紅蛋白及原始細胞百分比與野生型無明顯差別。具有 FLT3-ITD突變或 N-RAS突變的患者總體生存期（OS）較無相關突變組患者明顯縮短（OS=39.1月 VS OS=71.7月/OS=24.

6、79月 VS OS=68.02月），且差異有統(tǒng)計學意義（P=0.01/P=0.028）。WT1、FLT3-TKD、TET2、ASXL、EZH2等基因的突變型與野生型患者臨床特征無明顯差別；而MLL-PTD、IDH1及CBL等基因由于突變例數(shù)太少，和JAK1、DNMT3、c-Kit、NPM1、IDH2、RUNX1、JAK2(V617F)等基因一樣，未與臨床資料進行分析。
　　3.對84例APL患者均做了染色體核型分析，單純t(15;

7、17)70例，變異型t(11;17)1例，t(15;17)伴其他染色體異常13例，其中+8者4例，17號缺失者2例，9號缺失者2例，t(7;12)者1例，+21者1例，+15者1例，-Y者1例，+6者1例，-6者1例，7q+者1例，11號缺失者1例。細胞遺傳學與臨床特征及突變的關系：附加其他核型異常的APL患者與單純t(15;17)的患者相比，初診原始細胞百分比、白細胞、血小板、血紅蛋白及中位年齡等臨床特點無明顯差異；其總生存期（OS）

8、與單純t(15;17)患者有明顯縮短（28.94月VS67.10月），但差異無明顯統(tǒng)計學意義（P=0.576）。附加異常的 APL患者發(fā)生突變的幾率(6/13)并沒有明顯高于單純 t(15;17)的 APL患者(45/71)，且無明顯統(tǒng)計學意義（P=0.219）。
　　結論：
　　1.本實驗驗證了FLT3-ITD基因在AML及APL患者中的重大意義，突變率與前人報道大致相同，與在AML中一樣，F(xiàn)LT3-ITD基因突變是APL

9、患者的不良預后因素；另外，我們還發(fā)現(xiàn)N-RAS與APL疾病發(fā)生及預后的重要相關性，有5例病人發(fā)生了N-RAS第12號氨基酸的突變，有3種形式的突變形式，即c.G35>T/p.Gly12Val、c.G35>A/p.Gly12Asp、c.G34>A/p.GLY12Ser，且均為雜合突變；雖然突變例數(shù)較少，突變氨基酸序列發(fā)生的變換不一樣，但是經過統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)突變與患者的總體生存期有著明顯的相關性；突變患者還有較低的血小板計數(shù)等臨床特征，而高白

10、細胞計數(shù)及細胞遺傳學方面尚未發(fā)現(xiàn)有明顯聯(lián)系，這可能是本研究樣本數(shù)較少造成的。我們的研究結果表明FLT3、RAS基因所致信號轉導通路的基因突變與PML-RARα致轉錄因子突變協(xié)同參與了急性早幼粒細胞白血病的形成，即“二次打擊”學說；提示 APL的臨床診斷過程中的分子遺傳學水平檢測、預后危險度分層甚至這些突變發(fā)生機制的進一步研究是有必要及重要意義的。
　　2.通過我們的研究發(fā)現(xiàn)，APL患者細胞遺傳學附加異常對患者的預后及生存率無明顯影

11、響。目前國內外對這一方面研究還尚少，復雜細胞遺傳學異常不影響 APL患者預后可能與 APL靶向治療后緩解率高，生存期長，觀察時間較短有關，尚需要繼續(xù)隨訪；另外，本研究患者例數(shù)較少，需要擴大樣本量進一步驗證結論正確性。
　　第二部分:兩例非典型慢性髓細胞白血病的臨床及實驗室特征研究
　　目的：絕大多數(shù)慢性髓細胞白血?。–ML, chronic myeloid leukemia）患者具有特征性染色體易位t(9;22)(q34;q

12、11)，形成特異性的BCR-ABL融合基因，酪氨酸激酶抑制劑治療效果良好。然而，極少數(shù)CML患者中，不具有此類特異性遺傳學特征，而伴有其他基因可與其他伙伴基因相互易位，形成新的融合基因，此種 CML在2008WHO分型中被歸入骨髓增殖性腫瘤（MPN, Myeloproliferative neoplasms）中的非典型慢性髓細胞白血?。╝CML, atypical CML）。為了進一步認識aCML及探討其分子靶向治療機制，本文對2例罕見

13、的伴有BCR-JAK2及ETV6-PDGFRβ融合基因的aCML病例進行了臨床表現(xiàn)、實驗室特征、靶向治療及療效觀察等方面研究。
　　方法：挑選2例臨床診斷為非典型慢性粒細胞性白血病患者的骨髓細胞，按常規(guī)制備染色體懸液，經低滲、固定后收獲細胞，R顯帶、吉姆薩染色后進行核型分析。采用9p24（(5’-D9S1969和3’-SHGC-149694)）紅綠雙色探針（KREATECH）分析細胞分裂間期和分裂期的雜交信號；設計BCR/JAK2

14、及ETV6-PDGFRβ引物PCR擴增產物并序列分析。
　　結果：患者1，男性，28歲，因“發(fā)現(xiàn)白細胞升高四月”于2010年8月就診，外周血常規(guī)提示WBC50.1×109/L，PLT159×109/L，Hb128g/L。外周血涂片：中性粒細胞83%，淋巴細胞8%，單核細胞8%，晚幼粒細胞1%。骨髓形態(tài)提示骨髓增生極度活躍，粒系明顯偏高，粒紅比例偏高。骨髓組織活檢（塑料包埋）提示MDS/MPN骨髓象，aCML可能性大。應用流式細胞術

15、進行骨髓細胞的免疫表型分析，結果提示未見異常表達，粒系比例增高伴成熟障礙。R顯帶染色體核型分析提示：46,XY,ins(22;9)(p11;p13p24)[20]。依據(jù)核型分析顯示9p24斷裂點，分析可能累及位于9p24的JAK2基因，應用9p24/JAK2探針進行的FISH檢測結果顯示，大約50%的細胞出現(xiàn)陽性分離信號，證實存在JAK2基因的重排。RT-PCR提示BCR-ABL融合基因陰性，而BCR-JAK2引物進行PCR擴增得到特異

16、性條帶，測序證實為BCR/JAK2融合基因。該例患者診斷為伴有ins(22;9)(p11;p13p24)/BCR-JAK2的非典型慢性髓細胞性白血病，予以α干擾素及羥基脲治療，隨訪至2012年5月仍處于血液學緩解中。
　　患者2，男性，55歲，因“發(fā)現(xiàn)白細胞升高半月”于2012年6月來診，外周血常規(guī)提示WBC40.8×109/L，PLT278×109/L，Hb145g/L。外周血涂片：中性粒細胞82%，淋巴細胞3%，單核細胞2%，

17、嗜酸性粒細胞1%，嗜堿性粒細胞2%，晚幼粒細胞10%。骨髓形態(tài)提示粒系比例增高，粒紅比例偏高，紅系可見類巨幼樣變。應用流式細胞術進行骨髓細胞的免疫表型分析，結果提示1%幼稚群體，髓系表型，粒系比例增高伴成熟障礙。R顯帶染色體核型分析提示：46,XY, t(5;12)(q33;p13)[20]。RT-PCR提示 ETV6- PDGFRβ融合基因陽性。該例患者診斷為伴有t(5;12)(q33;p13)/ETV6-PDGFRβ的非典型慢性髓細