EVI1高表達急性髓系白血病的臨床、細胞遺傳學(xué)特征和初步發(fā)病機制的研究.pdf

1、目的:
　　1、分析2007年1月至2015年4月期間于本中心經(jīng)形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、細胞遺傳學(xué)分型(MIC)確診并住院接受治療的447例初診急性髓系白血病(AML)患者的EVI1表達水平，分析其臨床和細胞遺傳學(xué)等特征，對EVI1高表達患者的細胞遺傳學(xué)特征進行深入分析。
　　2、對151例處于第一次緩解期行清髓性異基因造血干細胞移植患者的EVI1表達特征和臨床意義進行分析，分析EVI1基因表達水平對患者預(yù)后的影響。
　　3、

2、采用基因芯片等技術(shù)手段篩選與EVI1高表達相關(guān)的微小RNA(microRNA)，并初步探討11p15重排導(dǎo)致EVI1高表達的機制。
　　方法:
　　1、通過制備質(zhì)粒標準品的方法建立EVI1絕對定量檢測的方法。利用建立的RQ-PCR方法對本中心447例初診AML患者的EVI1水平進行檢測，并收集患者的人口學(xué)、初診血細胞計數(shù)、形態(tài)學(xué)、細胞遺傳學(xué)和AML常見基因突變等資料;并對緩解率和緩解后的無白血病生存進行分析。
　　2、

3、回顧性分析了151例處于第一次緩解期接受清髓性異基因造血干細胞移植的AML患者，分析其臨床特點、移植類型、EVI1表達水平、細胞遺傳學(xué)特征和基因突變類型對患者預(yù)后的影響，并進行單因素和多因素的統(tǒng)計學(xué)分析。
　　3、通過microRNA表達譜分析研究與EVI1相關(guān)的microRNA的水平變化并對顯著負相關(guān)的兩種microRNA進行驗證以及靶基因預(yù)測;利用基因表達譜和RQ-PCR研究11p15重排的AML高表達EVI1的特點，并通過體

4、外轉(zhuǎn)染試驗初步揭示11p15重排和EVI1高表達之間的聯(lián)系。
　　結(jié)果:
　　1、成功構(gòu)建了EVI1定量檢測的標準品，驗證了RQ-PCR的工作曲線，對正常骨髓單個核細胞的EVI1表達進行了檢測，分別為EVI1-1d:99.812±94.823/10000PBGD, MDS1EVI1:186.171±188.678/10000PBGD, cEVI1:1198.428±1266.043/10000PBGD（均值±標準差），界定了

5、EVI1高低表達的界線值為10倍正常骨髓的均值。
　　在447例初診AML中，EVI1高表達者為80例（占17.9％），EVI1低表達者為367例（占82.1％）。兩組的年齡、性別分布無明顯差異，兩組外周血血紅蛋白水平、白細胞計數(shù)、血小板計數(shù)均未見到明顯差異。形態(tài)學(xué)方面，M5和M6在EVI1高表達組顯著增多（p=0.0038和0.01），M3在低表達組中有增多的趨勢(p=0.08)。
　　細胞遺傳學(xué)方面，顯著傾向于EVI1高

6、表達組分布的核型為11 q23/MLL重排、3q26重排、-7/7q-以及t(9;11)（p分別為＜0.0001，＜0.0001，0.0006，0.0135），尤其發(fā)現(xiàn)了5例存在重現(xiàn)性11p15重排的病例均伴有EVI1高表達(p＜0.0001)。擴大驗證后的12例11p15重排均發(fā)現(xiàn)EVI1高表達。而顯著傾向于在EVI1低表達組占優(yōu)勢的核型為正常核型、inv(16)、t(8;21)(p=0.001，0.009，0.002)。按照細胞遺傳

7、學(xué)危險度的分組分布中，低中高危組均顯示兩組分布的顯著性差異(p＜0.0001，p=0.044，p＜0.0001)，其中低、中危組在EVI1低表達組顯著占優(yōu)勢，而高危組則在EVI1高表達組占優(yōu)勢。AML常見突變方面，NPM1突變更傾向于分布于EVI1低表達組(p=0.0003)。結(jié)合了細胞遺傳許和分子突變特征的NCCN2014關(guān)于AML危險度的分層，高危組更傾向分布于EVI1高表達組(p＜0.0001)，而低危組傾向分布于EVI1低表達組

8、(p＜0.0001)。對于≤60歲的患者，EVI1高表達組緩解率明顯低于EVI1低表達組，兩組CR率分別為37.5％ v.s.69.4％，存在顯著性統(tǒng)計學(xué)差異(p＜0.0001)。兩組緩解后的無白血病生存也顯示類似趨勢(p=0.031)。對于11 q23/MLL重排，高EVI1表達在M5亞型多見，但無明顯統(tǒng)計學(xué)意義(p=0.231)，而t(11;19)(q23;p13)和t(6;11)(q27;q23)核型在EVI1高表達組顯示出優(yōu)勢的

9、趨勢(p=0.077)。11 q23/MLL重排中，EVI1高表達組的緩解率顯示出明顯低于低表達組的趨勢(p=0.061)。-7/7q-核型中，單獨-7占EVI1高表達組的比例更高(4/7)，兩組的完全緩解率未見顯著性差異。應(yīng)用FISH技術(shù)，發(fā)現(xiàn)3q26重排存在多種斷裂重排方式，并發(fā)現(xiàn)5例3q27、3q29重排為隱匿性3q26重排。
　　2、151例處于第一次緩解期行清髓性異基因造血干細胞移植的患者中，EVI1高表達組和低表達組比

10、較，年齡、性別、初診時外周血白細胞計數(shù)、骨髓原始細胞比例均無明顯差異;M5分型在高表達組更占優(yōu)勢(p=0.0015);細胞遺傳學(xué)構(gòu)成上，11 q23/MLL重排在高表達組更占優(yōu)勢(p＜0.0001)，正常核型在低表達組更占優(yōu)勢(p＜0.0001)。細胞遺傳學(xué)危險度中低危組占EVI1低表達組的比例更高(p＜0.0001)。常見的AML突變在兩組構(gòu)成中無明顯差異。
　　EVI1高表達和低表達組接受不含照射的MAC方案的比例、接受親緣或

11、無關(guān)供體的人數(shù)比、接受骨髓干細胞外周血造血干細胞和臍帶血干細胞來源的構(gòu)成比均未見顯著統(tǒng)計學(xué)差異。而在接受骨髓和外周血造血干細胞混合輸注方面，EVI1高表達組為14例(44％)顯著高于EVI1低表達組(p=0.0039)。在HLA匹配情況方面，采用部分相合供體的EVI1高表達組患者例數(shù)為16例(50％)，顯著高于EVI1低表達組(p=0.0333)。移植后所有患者均獲得造血重建，移植后1個月均獲得完全嵌合。100天內(nèi)累積aGVHD(Ⅱ-Ⅳ

12、°)發(fā)生率為21％±5％，7例患者發(fā)生重度aGVHD(Ⅲ-Ⅳ°)。累積cGVHD發(fā)生率為30％±10％。15例患者2年內(nèi)出現(xiàn)廣泛型cGVHD。
　　患者2年總體生存率為68.5％(59.9-76.5％);無事件生存率為67.4％(58.5-74.6％)。中位隨訪時間26個月（2-60個月）。EVI1高表達組24個月OS為52.8％(32.5-69.5％)，較低表達組72.4％(63-80％)顯著降低(p=0.0122);LFS為5

13、6.7％(34.9-73.7％)，同樣較低表達組76.1％(66.6-83.2％)顯著降低(p=0.0083)。以無復(fù)發(fā)死亡作為競爭性因素，EVI1高表達組24個月時的累積復(fù)發(fā)率顯著高于低表達組，分別為39.5％(20.9-57.6％)和22.5％(15.2-30.7％)(p=0.013)。針對LFS進行的單因素分析結(jié)果表明，EVI1低表達和中危的細胞遺傳學(xué)分組是有利于LFS的預(yù)后因素(p＜0.05)，而針對OS進行的單因素分析表明，更

14、低的年齡、EVI1低表達、ITD野生型、中低危的細胞遺傳學(xué)、NPM1野生型均為有利于OS的預(yù)后因素(p均＜0.05)。多因素分析結(jié)果表明，EVI1表達為LFS唯一的獨立預(yù)后因素，低表達有利于預(yù)后（HR=0.44，95％CI0.23-0.84，p=0.014）。ITD突變和低危、中危的遺傳學(xué)分型為OS的獨立預(yù)后因素。野生型ITD有利于預(yù)后(HR=0.31，95％CI0.15-0.63，p=0.001);低危核型利于預(yù)后(HR=0.11，9

15、5％CI0.01-0.86，p=0.03)，中危核型同樣有利于OS(HR=0.43，95％CI0.24-0.78，p=0.005)。以NCCN2014關(guān)于AML危險度分層取代細胞遺傳學(xué)分組和常見AML突變的單因素分析表明，EVI表達高低以及中危的NCCN分組對LFS的預(yù)后有顯著性影響，而多因素分析表明，僅有NCCN中危險度組為有利于OS的唯一有利因素(HR=0.37，95％CI0.21-0.64，p=0.0004)。基于細胞遺傳學(xué)分層對

16、EVI1的分層分析表明，EVI1表達狀態(tài)對LFS和OS均未產(chǎn)生明顯影響。
　　3、結(jié)合107例初診AML的microRNA表達譜分析以及EVI1定量分析，篩選出與EVI1表達負相關(guān)的microRNA為miR-181a(Fold change0.368，p=0.00018)、miR-128b(Fold change0.465, p=0.002)、miR-181c(Fold change0.470, p=0.001)、miR-128a

17、(Fold change0.479，p=0.002)，正相關(guān)的為miR-151-3p、mir-500、miR-143、miR-199a-5p、miR-363、miR-148a、miR-151-5p、miR-125a-5p、miR-99b。利用RT-PCR方法對驗證了71例初診AML的miR-128a的相對表達在EVI1高表達和低表達組中存在顯著性差異(p=0.0015)，miR-181a的相對表達存在顯著性差異(p=0.05)。利用Ta

18、rgetscan預(yù)測miR-128a的可能調(diào)節(jié)靶基因為HOXA9等HOX家族成員，miR-181a的可能調(diào)節(jié)靶基因為Bcl-2。
　　10例11p15重排的AML基因表達譜表明EVI1d型是NUP98重排白血病患者表達上調(diào)的主要形式，而ME(MDS1EVI1)剪接型表達則處于低水平。HOX家族中，HOXA3、HOXA4、HOXA5、HOXA7、HOXA9、HOXA10、HOXAB處于較高表達水平。RQ-PCR驗證證實8例t(7;1

19、1)((p15;p15)的EVI1表達中，cEVI1、EVI-1d升高，而MDS1/EVI1表達無明顯升高。
　　利用NUP98/HOXA9、NUP98/HOXD8對K562細胞和293T細胞的轉(zhuǎn)染表明，NUP98/HOXA9對293T細胞的轉(zhuǎn)染后cEVI1的相對表達有所上升。
　　通過構(gòu)建的連接NUP98/HOXA9不同結(jié)構(gòu)片段和EVI1啟動子區(qū)的熒光素酶報告系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)GLFG段對EVI1啟動子活性有顯著影響。
　　結(jié)

20、論:
　　1、EVI1高表達在AML中發(fā)生率為17.9％，在M5中較為多見，常見的細胞遺傳學(xué)異常包括11q23/MLL重排、3q26重排、-7/7q-以及t(9;11)和11p15重排。高表達組緩解率明顯降低，這一趨勢同樣表現(xiàn)在單獨進行的11q23/MLL重排患者中。
　　2、處于第一次完全緩解期接受清髓性異基因造血干細胞移植的AML患者，初診時EVI1高表達患者的無白血病生存率、總體生存率、累積復(fù)發(fā)率明顯差于低表達患者，E