誘導MSP58基因高表達對人腦膠質(zhì)瘤細胞系生物學特性的影響.pdf

1、腦膠質(zhì)細胞瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，其發(fā)生率約占全部顱內(nèi)腫瘤的30％～50％。盡管近年來在手術(shù)﹑化療與放療方面取得很大進步,但對膠質(zhì)瘤的治療效果并沒有得到顯著提高。腦膠質(zhì)細胞瘤治療困難的根本原因在于其所具有的惡性生物學特性，如膠質(zhì)細胞瘤具有典型的過度增殖、極強的侵襲性等等。因此，深入揭示腦膠質(zhì)細胞瘤發(fā)生與發(fā)展的分子生物學機制，闡明決定腦膠質(zhì)瘤惡性生物學行為的關(guān)鍵基因，對于人類戰(zhàn)勝這一頑疾具有重要的科學意義。
　　核微球蛋白

2、58(58-kDa microspherule protein，MSP58)是我們以抑癌候選基因NDRG2（N-myc down-stream regulated gene2）為誘餌、利用酵母雙雜交的方法篩選到的一個可以與NDRG2相互作用的分子。MSP58全長462個氨基酸。該分子結(jié)構(gòu)中包括:核仁定位信號;一個coiled-coil domain和一個forkhead associated domain(FHA)。目前國際上對MSP5

3、8的研究表明：MSP58的表達與細胞的增殖能力呈正相關(guān)，這個分子在細胞中表達具有明顯的細胞周期相關(guān)的特點，它在細胞中過表達可以引起細胞的克隆形成能力增強及非錨著依賴生長的惡性表型，MSP58系與多種腫瘤發(fā)生過程及細胞增殖中具有相互作用的一種癌基因。
　　我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，MSP58mRNA和蛋白在腦膠質(zhì)瘤組織中存在表達。MSP58表達在良性和惡性腦膠質(zhì)瘤之間，以及腦膠質(zhì)瘤～ⅠⅣ級病理級別間比較均有非常顯著的差異性（p<0.01）

4、，提示MSP58在腦膠質(zhì)瘤的形成和惡性演進中具有重要作用。然而對于MSP58在膠質(zhì)瘤細胞系中的生物學功能和作用機制仍有待于進一步研究。
　　本研究探討了MSP58分子誘導高表達對于人腦膠質(zhì)瘤細胞系體外增殖、侵襲和凋亡等生物學特性的影響，為揭示MSP58分子在人腦膠質(zhì)細胞瘤惡性進展中的作用提供了實驗基礎(chǔ)。本課題研究主要包括以下兩個方面：
　　1.MSP58真核表達載體轉(zhuǎn)染人腦膠質(zhì)母細胞瘤細胞系U251的研究
　　我們在前

5、期的研究中，針對四種最高級別惡性度的神經(jīng)膠質(zhì)瘤的細胞系：U215，U87，BT325，SHG44，運用RT-PCR和Westernblot的實驗方法，檢測了MSP58mRNA和蛋白在這四種膠質(zhì)瘤細胞系中的表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MSP58在膠質(zhì)瘤細胞系均有表達，并且表達量基本一致。根據(jù)這四種膠質(zhì)瘤細胞系的生物學特性及轉(zhuǎn)染效率等特點，我們選取了膠質(zhì)瘤細胞系U251作為研究對象，根據(jù)MSP58分子的cDNA序列，運用PCR得到MSP58全長，并

6、克隆入pCI-neo載體，構(gòu)建了MSP58真核表達載體pCI-neo-MSP58，經(jīng)酶切鑒定證實克隆正確。通過脂質(zhì)體介導、將pCI-neo-MSP58載體和空載體pCI-neo分別轉(zhuǎn)染入人腦膠質(zhì)母細胞瘤細胞U251，經(jīng)G418篩選，建立了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞系U251-Pmsp58（MSP58過表達組）和U251-Pneo（空載體組），經(jīng)RT-PCR和Westernblot檢測證實U251-Pmsp58細胞MSP58mRNA和蛋白的表達明顯上

7、調(diào)。
　　本部分結(jié)果提示：首次成功獲得了能夠穩(wěn)定過表達MSP58的膠質(zhì)瘤細胞系U251-Pmsp58，這為進一步研究MSP58表達對于膠質(zhì)瘤細胞生物學特性的影響提供了良好的細胞模型。
　　2.誘導MSP58高表達對人腦膠質(zhì)瘤細胞體外增殖及侵襲的影響
　　本研究觀察了MSP58基因?qū)δz質(zhì)瘤細胞增殖和細胞周期的影響。實驗分為U251-Pmsp58組（MSP58過表達組）、U251組（未轉(zhuǎn)染組）和U251-Pneo組（空載體

8、組），運用流式細胞術(shù)檢測細胞周期，MTT實驗繪制細胞生長曲線，平板克隆形成實驗和軟瓊脂集落形成實驗測定細胞克隆形成數(shù)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，U251-Pmsp58組與其他各對照組相比，G1期細胞明顯減少（p＜0.01），S期細胞顯著增多（p＜0.01）；U251-Pmsp58組細胞增殖數(shù)和克隆形成數(shù)均明顯高于其他各對照組（p＜0.01）。表明MSP58基因?qū)δz質(zhì)瘤細胞周期有重要影響，MSP58基因表達上調(diào)對細胞增殖有較為明顯的促進作用。
　

9、　為了探明MSP58基因與膠質(zhì)瘤的侵襲和遷移能力的關(guān)系，運用經(jīng)典的細胞劃痕實驗和Transwell侵襲小室法、就MSP58分子對細胞的遷移和侵襲能力的影響進行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，U251-Pmsp58組的膠質(zhì)瘤細胞的遷移能力明顯高于其他對照組（p＜0.01），并且在Transwell實驗中，U251-Pmsp58組的膠質(zhì)瘤細胞能夠穿過Matrigel的細胞數(shù)也明顯高于其他對照組（p＜0.01）。從而證明上調(diào)MSP58基因的表達能夠促進膠質(zhì)

10、瘤細胞的侵襲和遷移能力。
　　本部分研究結(jié)果提示，MSP58的高表達可能與人腦膠質(zhì)瘤細胞的體外增殖和侵襲等惡性生物學行為密切相關(guān)。
　　綜上所述，本研究首次建立了具有穩(wěn)定上調(diào)MSP58基因mRNA和蛋白表達的膠質(zhì)瘤細胞系；闡明了MSP58基因在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞增殖、遷移和侵襲中的作用。作為與NDRG2相互作用的分子，本研究結(jié)果為NDRG2功能的研究開辟了新的領(lǐng)域，對于揭示腦膠質(zhì)瘤發(fā)生與發(fā)展的分子生物學機制，闡明決定腦膠質(zhì)瘤惡性