MSP58基因在人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤增殖和侵襲中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、神經(jīng)膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤,在所有顱內(nèi)腫瘤中膠質(zhì)瘤約占40％,預(yù)后較差,其中惡性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的平均生存期僅為9-12月[1-2]。盡管近年來(lái)在手術(shù)﹑化療與放療方面取得很大進(jìn)步,但對(duì)膠質(zhì)瘤的治療效果并沒有得到顯著提高。現(xiàn)在美國(guó)每年大約有20000人被診斷為膠質(zhì)瘤,另有研究表明在中國(guó)的大陸、臺(tái)灣及香港等地區(qū)，膠質(zhì)瘤在青少年中的發(fā)病率呈增長(zhǎng)的趨勢(shì)[3-5]。惡性膠質(zhì)瘤治療困難的原因之一在于其所具有的惡性生物學(xué)特性，如膠質(zhì)瘤具有典

2、型的過度增殖和極強(qiáng)的侵襲性。因此尋找關(guān)鍵的治療膠質(zhì)瘤的分子靶點(diǎn)，糾正和改善其惡性生物學(xué)行為，越來(lái)越受到研究者們的高度重視。為了尋找治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的分子靶點(diǎn)，1999年我校生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室利用基于PCR的削減雜交技術(shù)進(jìn)行神經(jīng)膠質(zhì)瘤與正常腦組織的基因表達(dá)差異研究時(shí)，發(fā)現(xiàn)一個(gè)在膠質(zhì)瘤中低表達(dá)的新基因NDRG2（N-mycdown-streamregulatedgene2）[GenBank登錄號(hào)AF159092][6]。NDRG2的m

3、RNA全長(zhǎng)為2024bp,編碼一個(gè)含有357個(gè)氨基酸殘基、分子量約為41kDa的蛋白。該基因染色體定位在14q11.2，含有16個(gè)外顯子，15個(gè)內(nèi)含子。由于該基因在結(jié)構(gòu)上與已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的N-myc下游調(diào)節(jié)基因NDRG1(N-mycdown-streamregulatedgene1)具有較高的同源性，將其命名為NDRG2。
　　初步研究表明，過表達(dá)NDRG2可以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖。但目前國(guó)內(nèi)外對(duì)NDRG2功能的研究尚處于起步階段,對(duì)該

4、基因抑制膠質(zhì)瘤增殖的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑尚不清楚。闡明相關(guān)的分子機(jī)制有利于為NDRG2功能的研究提供理論依據(jù),同時(shí)也為發(fā)展臨床膠質(zhì)瘤的治療提供新的途徑。
　　絕大多數(shù)分子在細(xì)胞內(nèi)執(zhí)行功能都是通過蛋白與蛋白之間的相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)的。研究一個(gè)新基因的功能有多種策略，其中一個(gè)重要手段是尋找與之相互作用的蛋白分子，尤其是對(duì)于在結(jié)構(gòu)分析中未見到任何功能提示的分子，這更是一個(gè)關(guān)鍵策略。為了深入地闡明NDRG2的功能及其在細(xì)胞內(nèi)的作用機(jī)制,我們以NDRG

5、2為誘餌利用酵母雙雜交的方法篩選了人腦的cDNA文庫(kù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)了一個(gè)可以與NDRG2相互作用的分子MSP58（58-kDamicrospheruleprotein）,并通過在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了兩個(gè)分子之間的相互作用[7]，通過構(gòu)建NDRG2和相互作用分子的截短體，確定了它們相互作用的部位。MSP58成為闡明NDRG2基因功能的新線索。
　　MSP58是我們以NDRG2為誘餌利用酵母雙雜交的方法篩選到的一個(gè)可以與NDRG2相互作用的分

6、子。MSP58全長(zhǎng)462個(gè)氨基酸。該分子結(jié)構(gòu)中包括:核仁定位信號(hào);一個(gè)coiled-coildomain和一個(gè)forkheadassociateddomain(FHA)[8]。目前國(guó)際上對(duì)MSP58的研究表明：MSP58的表達(dá)與細(xì)胞的增殖能力呈正相關(guān)[9]，這個(gè)分子在細(xì)胞中表達(dá)具有明顯的細(xì)胞周期相關(guān)的特點(diǎn)，它在細(xì)胞中過表達(dá)可以引起細(xì)胞的克隆形成能力增強(qiáng)及非錨著依賴生長(zhǎng)的惡性表型，MSP58可以與多種在腫瘤的增殖及發(fā)生過程中有著重要作用的

7、分子產(chǎn)生相互作用[10],是一個(gè)在腫瘤的增殖中有著重要作用的癌基因。
　　那么MSP58基因在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中是否有表達(dá)？其表達(dá)的程度如何？增殖和侵襲力強(qiáng)是神經(jīng)膠質(zhì)瘤明顯的生物學(xué)特性，MSP58是否對(duì)膠質(zhì)瘤的增殖和侵襲有作用？其作用的分子機(jī)制是什么？本課題就基于這些問題展開了探索工作。
　　本研究收集了41例不同病理級(jí)別的神經(jīng)膠質(zhì)瘤的標(biāo)本，應(yīng)用RT-PCR和Westernblot實(shí)驗(yàn)方法，探索MSP58基因在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中mRNA

8、和蛋白的表達(dá)情況，并進(jìn)一步分析了MSP58分子的表達(dá)與神經(jīng)膠質(zhì)瘤病理級(jí)別之間可能存在的相互關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MSP58mRNA和蛋白在不同病理級(jí)別的神經(jīng)膠質(zhì)瘤中均有表達(dá)，并且隨著WHO的臨床病理級(jí)別的增高，MSP58的表達(dá)亦有增高的趨勢(shì)。本研究進(jìn)一步采用了四種最高級(jí)別惡性度的神經(jīng)膠質(zhì)瘤的細(xì)胞系：U251，U87，BT325，SHG44，同樣應(yīng)用RT-PCR和Westernblot的實(shí)驗(yàn)方法，檢測(cè)了MSP58mRNA和蛋白在這四種膠質(zhì)瘤細(xì)胞

9、系中的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MSP58在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系均有高表達(dá)，并且表達(dá)量基本一致。根據(jù)這四種膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的生物學(xué)特性及轉(zhuǎn)染效率等特點(diǎn)，我們選取了膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251為研究對(duì)象，根據(jù)MSP58分子的cDNA序列，設(shè)計(jì)、合成了針對(duì)MSP58mRNA的特異性RNAi片段，并克隆入pSilencer3.1-H1neo載體，構(gòu)建了MSP58shRNA真核干涉表達(dá)載體pSilencer-MSP58，經(jīng)酶切鑒定證實(shí)克隆正確。通過脂質(zhì)體介導(dǎo)將pSile

10、ncer-MSP58載體和空載體pSilencer3.1-H1neo和陰性對(duì)照載體pSilencer-NC分別轉(zhuǎn)染入人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞U251，經(jīng)G418篩選，建立了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系U251-S（MSP58干涉組）、U251-H1neo（空載體組）和U251-NC（陰性對(duì)照載體組）。經(jīng)RT-PCR和Westernblot檢測(cè)證實(shí)U251-S細(xì)胞MSP58mRNA和蛋白的表達(dá)明顯受到抑制。從而首次成功地獲得了能夠穩(wěn)定下調(diào)MSP58表達(dá)的

11、膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251-S。這為進(jìn)一步研究MSP58在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的功能和作用機(jī)制奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　本研究首先觀察了MSP58基因?qū)δz質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響。實(shí)驗(yàn)分為U251-S組（MSP58干涉組）、U251組（未轉(zhuǎn)染組）、U251-H1neo組（空載體轉(zhuǎn)染組）和U251-NC組（陰性對(duì)照載體轉(zhuǎn)染組）。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期，MTT實(shí)驗(yàn)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，平板克隆形成實(shí)驗(yàn)和軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞克隆形成數(shù)量。結(jié)果發(fā)

12、現(xiàn)U251-S組與其它各對(duì)照組相比，G1期細(xì)胞明顯增加（p＜0.01），G2/M期細(xì)胞明顯減少（p＜0.01），細(xì)胞周期發(fā)生了G1期阻滯現(xiàn)象；U251-S細(xì)胞增殖數(shù)和克隆形成數(shù)均明顯低于其它各對(duì)照組（p＜0.01）。表明MSP58基因?qū)δz質(zhì)瘤細(xì)胞周期有重要影響，MSP58基因表達(dá)下調(diào)對(duì)細(xì)胞增殖也有明顯的抑制作用。
　　為了探明MSP58基因與膠質(zhì)瘤的侵襲和遷移能力的關(guān)系，采用經(jīng)典的細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲小室法，就MS

13、P58分子對(duì)細(xì)胞的遷移和侵襲能力的影響進(jìn)行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，U251-S組的膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移能力明顯低于其它對(duì)照組（p＜0.01），并且在Transwell實(shí)驗(yàn)中，U251-S組的膠質(zhì)瘤細(xì)胞能夠穿過Matrigel的細(xì)胞數(shù)也明顯低于其它對(duì)照組（p＜0.01）。從而證明下調(diào)MSP58基因的表達(dá)能夠抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力。
　　本研究采用裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了以上結(jié)果在體內(nèi)的重復(fù)性。32只裸鼠隨機(jī)分為四組，將U251-S、U

14、251、U251-H1neo和U251-NC組的細(xì)胞分別注入各組裸鼠皮下，觀察其在裸鼠體內(nèi)的成瘤性。共觀察了24天。結(jié)果顯示，U251-S組細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的成瘤能力和生長(zhǎng)速度明顯低于其它對(duì)照組（p＜0.01），腫瘤體積和重量明顯低于其它各對(duì)照組（p＜0.01）。在體實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步印證了MSP58基因表達(dá)的下調(diào)抑制了神經(jīng)膠質(zhì)瘤的增殖和侵襲能力。
　　在上述研究的基礎(chǔ)上，本研究使用美國(guó)SuperArray公司推出的第二代功能分類基因芯

15、片，對(duì)MSP58對(duì)照組和干涉組細(xì)胞的細(xì)胞周期和腫瘤相關(guān)基因進(jìn)行了基因芯片對(duì)比分析研究，探討MSP58作用的信號(hào)途徑。美國(guó)SuperArray基因芯片對(duì)基因進(jìn)行了有目的的篩選與分類，從而避免了高通量基因芯片因數(shù)據(jù)過多而難以分析的缺點(diǎn)?；蛐酒姆治鼋Y(jié)果顯示：MSP58的下調(diào)引起了某些抑癌基因的上調(diào)，如BRCA1和P53基因，同時(shí)也下調(diào)了某些增殖相關(guān)基因如Ki-67和E2F2的表達(dá)。對(duì)于細(xì)胞周期相關(guān)基因芯片而言，一些與細(xì)胞周期中G1-S期細(xì)

16、胞周期轉(zhuǎn)換抑制的相關(guān)基因，如ATM，ATR，CyclinG1，CyclinG2，Cullin4A以及Cullin5等均出現(xiàn)了上調(diào)。同時(shí)一些與細(xì)胞周期G2/M期有密切關(guān)系的基因如ANAPC2，ANAPC4以及ANAPC5出現(xiàn)了上調(diào)。
　　本研究發(fā)現(xiàn)MSP58基因在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)，且表達(dá)水平隨神經(jīng)膠質(zhì)瘤病理級(jí)別的增高而升高；利用RNAi技術(shù)，首次建立了具有穩(wěn)定下調(diào)MSP58基因mRNA和蛋白表達(dá)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系；闡明了MSP58