RNA干涉RPS12基因?qū)ξ赴┘?xì)胞生物學(xué)特性的影響及分子機(jī)制探討.pdf

1、胃癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人類(lèi)的健康。多種癌基因和抑癌基因的異常與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但是目前關(guān)于對(duì)胃癌防治具有重要意義的靶基因報(bào)道很少。因此，研究與胃癌密切相關(guān)的基因十分必要。為此本課題組前期應(yīng)用抑制消減雜交(SSH)篩查發(fā)現(xiàn)一些在胃癌中差異表達(dá)的基因，進(jìn)一步應(yīng)用基因芯片、斑點(diǎn)雜交等技術(shù)檢測(cè)相關(guān)基因在異型增生、早期胃癌、進(jìn)展期胃癌組織、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌以及癌旁組織中的表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)了這些基因在胃癌發(fā)生發(fā)展不同階段的差異表達(dá)

2、情況。核糖體蛋白S12(Ribosomal protein S12，RPS12)基因是其中之一。該基因在胃癌發(fā)生發(fā)展不同階段病變的標(biāo)本中表達(dá)增高，是胃癌發(fā)生、發(fā)展不同階段的重要差異表達(dá)基因。但是該基因在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用究竟如何，有待通過(guò)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。在前期工作的基礎(chǔ)上，為深入研究RPS12基因在胃癌中的作用，本課題擬構(gòu)建RPS12基因shRNA表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞并證實(shí)對(duì)RPS12基因的抑制作用后，觀察對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)特性如細(xì)胞

3、凋亡、增殖的影響，并探討其分子機(jī)制。本研究將加深對(duì)胃癌分子機(jī)制的理解，并有望發(fā)現(xiàn)胃癌診治、預(yù)后判定的新標(biāo)志。 材料及方法： 1．實(shí)驗(yàn)材料：胃癌細(xì)胞系BGC823、RPMI1640培養(yǎng)基、TRIZOL Reagent、Taq DNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒(Qiagen)；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒(invnrogen)，BamH Ⅰ、HindⅢ、EcoR Ⅰ核酸內(nèi)切酶(Takara)；PI、JM109感受態(tài)細(xì)胞(聯(lián)星公

4、司)等。 2．實(shí)驗(yàn)方法：應(yīng)用重組DNA技術(shù)構(gòu)建RPS12特異性shRNA表達(dá)載體，基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將RPS12特異性shRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞，以scramble-shRNA為對(duì)照，RT-PCR方法檢測(cè)BGC823細(xì)胞中．RPS12基因的表達(dá)，證實(shí)干涉效應(yīng)。MTT、流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)分析RNA干涉后細(xì)胞增殖和凋亡，以探討RPS12基因?qū)ξ赴┘?xì)胞生物學(xué)特性的影響。同時(shí)采用RT-PCR檢測(cè)RNA干涉后