抗肺癌單鏈抗體的構(gòu)建、表達(dá)、純化及初步活性鑒定.pdf

1、單鏈抗體是利用基因工程方法使抗體重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)通過一段約5-25個aa的連接肽，首尾拼接而成的重組蛋白。本實驗所研究的抗肺癌單鏈抗體(LC-1single-chainFv，LC-1ScFv)是由抗肺癌雜交瘤細(xì)胞株(LC-1)分泌的單克隆抗體經(jīng)過基因改造得到的，是具有與抗原結(jié)合能力的最小抗體片段。目前，由于單鏈抗體的優(yōu)越性，它在許多腫瘤疾病的臨床診斷及免疫治療中已經(jīng)取得廣泛的應(yīng)用，如體內(nèi)顯像、放射免疫治療、免疫毒素

2、治療等。本實驗的目的是利用基因工程技術(shù)獲得有活性的抗肺癌單鏈抗體。 本實驗從高分泌量和活力較高的抗肺癌雜交瘤單克隆細(xì)胞株中抽提總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。設(shè)計引物從cDNA中PCR克隆出抗體的重鏈和輕鏈基因，克隆到T載體保存并測序，并且通過酶切鑒定。將重鏈和輕鏈基因經(jīng)重疊延伸PCR法構(gòu)建為單鏈抗體形式，回收并與T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌。以上游引物Vsbak和下游引物Vsfor為引物，以T-ScFv'為模板PCR，對單鏈抗體基因進(jìn)

3、行改造得到ScFv。回收PCR產(chǎn)物，酶切后連接于pET-22b(+)質(zhì)粒構(gòu)建成pET22-ScFv質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，重組蛋白得到高效表達(dá)而形成包涵體。抽提包涵體蛋白，得到較純的目的蛋白，通過蛋白復(fù)性技術(shù)使之復(fù)性，本文對復(fù)性條件進(jìn)行了摸索。用Ni-NTA樹脂純化出目的蛋白，SDS-PAGE電泳分析其純度，并初步分析目的蛋白活性。競爭ELISA實驗表明產(chǎn)物具有與天然抗體相近的活力。 本實驗成功地構(gòu)建了pE

4、T22-ScFv基因，然后利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)以包涵體的形式表達(dá)了pET22-ScFv蛋白，表達(dá)產(chǎn)物為分子量31kD左右的蛋白分子，與預(yù)期一致。大量表達(dá)目的蛋白，并對表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行了純化和復(fù)性，獲得了具有與天熱抗體相近活力的LC-1ScFv。 本實驗獲得了能夠與LC-1肺腺癌單抗相關(guān)抗原反應(yīng)的ScFv，從而為其靶向診斷、治療及進(jìn)一步基因工程改造奠定了基礎(chǔ)。此外，還可以應(yīng)用基因工程技術(shù)得到ScFv融合蛋白，它和ScFv一樣能在各